抽象的
Volanesorsen(以前被称为ISIS 304801)是一个20个核苷酸部分2 ' -O.-(2-甲氧基乙基)(2 ' - moe) -修饰的反义寡核苷酸(ASO) gapmer，最近被欧盟批准为一种新型的、领先的降低家族性乳糜红细胞综合征患者甘油三酯水平的治疗方法。在放射性标记或非放射性标记的研究中，我们描述了volanesorsen在小鼠、大鼠、猴子和人类中的吸收、分布、代谢和排泄特征。这也包括对所有从尿液中排泄的ASO代谢物的表征。Volanesorsen与小鼠、猴子和人类相似的血浆蛋白高度结合。在所有物种中，血浆浓度以多相方式下降，其特征是在皮下注射后，初始分布阶段相对较快，然后是较慢的最终消除阶段。不同种属的鼠尾草的血浆代谢谱相似，主要成分为鼠尾草。在小鼠和猴子的多次剂量研究中，在组织中发现了各种缩短的寡核苷酸代谢物(5-19核苷酸长)，但在[3.H] -Volanesoren RAT研究，可能由于大鼠单剂量后代谢物的较低积累。在尿液中，观察到组织中鉴定的所有代谢产物，与内核和外切酶介导的代谢和尿排泄是一致的，是ValaneSorsen的主要消除途径及其代谢物。
意义陈述在从临床前毒理学研究中收集的样品中，从小鼠中表征来自小鼠的局部2'-Moe改性的反义寡核苷酸，局部2'-Moe改性的反义寡核苷酸的吸收，分布，代谢和排泄（Adme），是从小鼠到人的样品中的一种。3.H大鼠ADME研究，1期临床试验。
介绍
罕见的遗传障碍是通过传统的小分子药物治疗的挑战。使用反义寡核苷酸（ASOS）作为用于治疗这些疾病的药物开发平台，由于它们在RNA水平的独特作用机制（Bennett和Swayze, 2010年)．ASOS与其靶标互补mRNA杂交，其可以改变通过RNase H活性的剪接或导致RNA降解的部位，从而调节蛋白质的翻译或消除毒性RNA（Croke，1999那2004年)．药用化学的进步导致了几种化学修饰，这已经提高了ASOS的药代动力学和药物动力学特性（瓦格纳，1994年;Altmann等人。，1996年;Lima等人。，1997年;Manoharan，1999)．在各种修饰中，磷酸二酯主链结构和2 ' -上的硫代磷酸修饰O.- （2-甲氧基乙基）（2'-MOE）对核糖部分的改性一致地对靶mRNA的较高的代谢稳定性和更高的结合亲和力，同时通过使用嵌合设计策略并降低一般非发生毒性（Manoharan，1999;McKay.et al。, 1999年;达尼斯et al。，2001年;yu.et al。，2007年;齿轮，2009年)．这2'-Moe修饰通常称为第二代ASO。2-甲氧基乙基改性导致有效，药理学活性，特异性ASO，如Mipomersen（市场为kynamro），载脂蛋白B-100合成的抑制剂用于减少低密度脂蛋白胆固醇，载脂蛋白B，总胆固醇，纯合家族高胆固醇血症患者的非高密度脂蛋白胆固醇（Kastelein等，2006年）和Inotersen（以TEGSEDI销售），用于减少血清Transthyretin蛋白和遗传性Transthyretin介导的淀粉样蛋白症（Ackermann等。，2016年;Benson等人。，2018年;沉和科瑞，2018年)．
Volanesorsen是一种20核苷酸部分2 ' - moe修饰的ASO gapmer，被开发用于抑制载脂蛋白C-III (APOC3)，后者在甘油三酯和富含甘油三酯的脂蛋白的代谢中起关键作用。编码APOC3的基因过表达与高甘油三酯血症相关，而APOC3的功能突变与低甘油三酯水平和心血管疾病风险降低相关(格雷厄姆等人。，2013年;杨等人，2016)．具有过表达Apoc3的患者可以具有高于〜1000mg / dL的甘油三酯水平，并且与胰腺炎的风险增加有关（Schmitz和Gouni-Berthold，2018年)．使用volanesorsen治疗可显著降低APOC3生成和甘油三酯浓度(Pechlaner等人，2017年）最近已被欧洲联盟批准为家族性Chylomronicro症综合征患者甘油三酯水平降低的小说。ValaneSorsen的药代动力学和代谢特性已经通过小鼠的物种彻底表征，包括小鼠和猴子的代谢作为毒理学研究的一部分，在使用放射性标记材料的大鼠中，以及来自一期健康志愿者研究的人类。这些研究的结果在物种中描述并进行了比较。另外，报道了所有ASO代谢物物种的肾脏排泄。该编译代表部分2'-MoE改进的AS的完全代谢谱。
材料和方法
测试化合物
Volanesorsen(也被称为ISIS 304801, ISIS- apociii处方和ionis-apociii处方）是一种20碱基硫代磷酸寡核苷酸，其具有五个2'-MOE改性的核糖核糖基核苷酸，在未改性的DNA寡核苷酸间隙的5'-和3'-末端（图1)．通过液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）测定的测试化合物的全长纯度结果为91.1％，含有1.6％与N-1相关的杂质（缺失序列）。基于全长20-MEL寡核苷酸的量进行剂量。将放射性标记的ValaneSorsen（Am Chemicals Llc，Ca）制成（Am Chemicals LLC，CA），其中氚掺入寡核苷酸的翼部分中的一种脱氧 - 胸苷核苷酸的核糖糖的不掺杂5-碳位置（图。1用于大鼠的放射性标记物质和质量平衡研究。[中的无线电化学纯度3.H]-volanesorsen的活性为97.1，比活性为1956µCi /毫克。
valaneSorsen的序列和结构，硫代磷酸酯反义寡核苷酸，位于1-5和15-20的位置，2'-MOE改性（下划线）。所有的胞嘧啶都是5-甲基化的3.H标签放置在胸腺嘧啶(用星号标记)在核糖C-5位置。
小鼠、大鼠和猴子的毒理学研究
所有动物研究均采用动物护理和使用委员会批准的协议和方法进行，并按照美国国家卫生研究院(Bethesda, MD)通过和颁布的《实验室动物护理和使用指南》进行。雄性和雌性CD-1小鼠(Charles River Laboratories, Inc.， Wilmington, MA)被用于亚慢性(6或13周给药，13周恢复)和慢性研究(26周给药，26周恢复)。Volanesorsen每隔一天皮下注射3、30或100 mg/kg，共4个剂量(负荷方案)，随后每周给药，持续6周;4、12、40或100 mg/kg，每隔一天给药4次(负荷方案)，然后每周给药13周，亚慢性研究有13周的恢复期;或3、10、30或80 mg/kg，每第三天给药三次(负荷方案)，然后每周给药，持续26周，慢性研究有26周的恢复期。对选定的样本进行代谢研究，包括:1)亚慢性研究(分别为42天、42天、给药后1小时和给药后7天)中30 mg/kg剂量的动物的峰值和低谷血浆样本;2)亚慢性研究的组织，包括从第44天到第93天的肝脏和肾脏样本。那approximately 48 hours after the doses on days 42 and 91, respectively, with a subset of tissues from day 93 also being used for the mass spectrometry (MS) identification study] from animals that received a 12 mg/kg dose and day 182, 13 weeks after the last dose, from animals that were dosed with 100 mg/kg; and 3) urine from the chronic study from 0 to 24 hours and 24–48 hours postdose on day 175 from animals that received the 80 mg/kg dose.
雄性和雌性Sprague-Dawley大鼠(Charles River Laboratories, Inc.)被用于一项为期2年的致癌性研究。Volanesorsen以0.2、1或5 mg/kg皮下注射，每周一次，持续92天。在给药的最后一天(第92天)，对所有剂量水平的血浆药动学参数进行了研究。
男性和雌性肉豆蔻猴（猕猴属筋膜;Sierra生物医学动物殖民地，火花，NV）在小鼠研究中所做的次级和慢性研究中使用。每隔一天给予4,8,12，或40mg / kg的皮下注射率施用vlaneSorsen以进行四个剂量（装载方案，例外，该4,8和12mg / kg的前三剂量给药的动物通过1小时的静脉输注），然后每周给药13周，次级调整研究;在第1周（加载方案）期间，3,6,12或20mg / kg（加载方案），然后每周给药，慢性研究持续39周。metabolism was studied in selected samples including: 1) peak and trough plasma samples from the subchronic study [2 hours postdose on day 91 and predose on day 91 (i.e., 7 days postdose on day 84) from animals that received the 8 mg/kg dose]; 2) tissues from the subchronic study including both liver and kidney cortex samples collected on days 44, 93, and 182 (i.e., approximately 48 hours after the dose on day 42, day 91, or 13 weeks after the dose on day 91 from animals that received the 12 mg/kg dose, with a subset of tissues from day 93 also being used for the MS identification study); and 3) urine from the chronic study from 0 to 24 hours and 24–48 hours postdose on day 252 from animals that received the 20 mg/kg dose.
使用[的吸收，分布，代谢和排泄和排泄性研究3.h] -volanesorsen.
在单一剂量的情况下，在雄性和女性Sprague-Dawley大鼠（Charles River Laboratories，Inc.）中研究了vlaneSorsen的吸收，分布，代谢和排泄（Adme）（Charles River Laboratories，Inc。）3.H]-volanesorsen皮下注射剂量分别为5和25 mg/kg，分别为100和500µCI / kg分别。药代动力学，组织分布和质量平衡样品来自动物施用的单一皮下剂量为5mg / kg [3.H]-volanesorsen，而定量全身放射自成像和额外的代谢物分析和鉴定样品来自单次皮下注射剂量为25 mg/kg的动物[3.H] -volanesorsen。
药代动力学和人类代谢
1期临床研究（ISIS 304801-CS1）在健康的男性志愿者（年龄28-52岁，体重在21.1和29.6 kg / m之间的体重指数之间的56.4和110.4千克。2那N=每治疗组4例，随机3例有效:1例安慰剂，除N= 4第1天的400mg多剂量队列的4）涉及在50,100,200或400mg的单一皮下注射，或多个皮下注射（六个总量），50,100,200或400mg在第一周的交替日（第1,3和5天），然后每周一次3周（第8,15,22天）。metabolism was evaluated in patients who received multiple administrations at 400 mg and included: both peak and trough plasma samples [4 hours postdose on days 22 and 29 (i.e., approximately 7 days postdose on day 22)], and urine samples collected from 0 to 24 hours postdose after the first (day 1) and last (day 22). All subjects provided their written, informed consent. The study protocol was approved by a central institutional review board (Institutional Review Board Services, Canada) and performed in compliance with the standards of good clinical practice and the Declaration of Helsinki in its revised edition.
分析方法
杂交酶联免疫吸附测定。
使用定量的敏感的杂交ELISA方法测定血浆浓度，其是先前报告的方法的变化Yu et al. (2002)．简而言之，杂交血液互补序列（5' -ataAA.GCT.GGacaagaAgct-3'，锁定的核酸修饰下划线），含有5'-末端的生物素和在3'-末端的Digoxigenin，以血浆中存在的vlaneSorsen，随后将杂交的复合物固定在中性化蛋白涂覆的板上。．然后加入S1核酸酶以切割任何未杂交的检测探针。然后在添加与碱性磷酸酶缀合的抗唑氧基蛋白蛋白酶后的杂交复合物的测量，催化催化剂（Promega，Madison，Wi）的转化形成荧光产品。通过加入15％Na终止反应2HPO.4.·7小时2O，然后用荧光板读数仪测量荧光强度。本检测方法的校准范围为1.0 - 100 ng/ml，该范围的下限(1.0 ng/ml)确定定量下限。样品的最大稀释度为10,000，以适应校准范围。在分析小鼠、大鼠、猴子和人类血浆样品前，验证了该方法的精密度、准确度、选择性、灵敏度和稳定性。用合成的推测缩短的寡核苷酸代谢物标准进行的分析显示没有可测量的交叉反应性，证实了该分析对亲本寡核苷酸的特异性。
测定蛋白质绑定。
超滤方法（Watanabe等人。，2006年)测定血浆蛋白结合程度。来自小鼠、猴子和人类的新鲜血浆被用来评估两种浓度(5和150)的蛋白结合μ.g / ml）括起来C马克斯期望在临床前和临床研究中评估的剂量范围。等分试样（50.μ.超滤液(含未结合的沃拉尼索尔森)和初始血浆样品[含总(结合和未结合的)沃拉尼索尔森]使用前面描述的相同的核酸酶依赖杂交ELISA方法进行测定。然后，测定未结合的volanesorsen的百分比(超滤液中的浓度除以初始血浆浓度)，由此计算结合的volanesorsen的百分比。所有样品均以至少1:4的浓度稀释到混合血浆中，以保证酶联免疫试剂盒的正常运行，大多数样品的浓度均大于1:4，以适应校准范围。
LC-MS/MS代谢物鉴定
从小鼠、猴子和人类研究中选取的血浆、组织和尿液样本，采用与先前报道相似的方法提取和分析(Yu et al.， 2016)．简单地说，所有样品首先均质，并有内部标准ISIS 355868 (5 ' -GCGTTTGCTCTTCTTCTTGCG.TTTT.TT-3'，在提取前加入2'-MoE改性寡核苷酸的27-MEL硫代磷酸酯2'-MOE部分修饰的寡核苷酸。通过首先使用苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）进行液 - 液萃取来完成，然后使用96孔Strata X包装板（现象X Inc.，CA.)．在洗脱液在50℃下在氮气下在氮气下干燥之前，样品通过蛋白质沉淀板（现象x Inc.）进行另外的通过。用140重构样品µL水含100µM EDTA。
通过与Agilent 1100 LC / MS系统（Agilent Technologies，Wilmington，DE）进行离子对LC-MS / MS进行分析样品，其中由25mM Tributylammonium（TBAA），pH中的25％乙腈组成的加载流动相。7.0，首先将流量反转之前注射到装载柱上（宽孔C18保护柱，4×2.0mm;现象X Inc.）用X桥柱分离寡核苷酸（50mm×2.1mm，2.5µM粒径，200埃孔径;水域，米尔福德，ma）。用5mM TBAA，pH7.0中的27％乙腈在5mm，pH7.0中平衡柱，并在55℃下保持，流速为0.3ml / min。在串联MS测量之前，在260nm处收集首先通过光电二极管阵列检测器和UV吸光度。将单个四极孔质谱仪设定为扫描900-1900的质量电荷比窗口，并使用35psig的4 kV，鞘气流的喷射电压获得质谱，干燥气体流速为12升/分钟在335℃下，使用Agilent ChemStation软件分析-150V的毛细管电压。
辐射分析(液体闪烁计数)。
通过使用Wallac 1409自动液体闪烁计数器（Beckman Coulter，Ca），通过液体闪烁计数定量大鼠样品中的放射性。尿液和血浆样品直接与Ultima金LSC鸡尾酒（PerkinElmer Life和Analytical Sciences，Boston，Ma）混合。对于溶解的组织样品，将金黄醇（2mL）加入每个小瓶中。然后将小瓶孵育过夜（约50℃约16小时）。将Ultima金闪烁鸡尾酒（10mL）和甲醇（1mL）加入每个小瓶中。使用自动样品氧化剂进行粪便和骨的氧气燃烧。燃烧产物在单相S中被吸收，用于测量放射性浓度。
氚交换评价。
交换范围(%)3.具有体水的H-放射性标记从曲线（AUC）下的末端速率常数和面积外推到挥发性放射性的无限内（假设是3.H2o）使用表达式：100×（V.·K.·AUC) /D.， 在哪里V.配送量是多少3.H2O(毫升;身体可交换水分=体重的60%)(Richmond等人，1962年），K.是终端速率常量3.H2O(小时-1;使用挥发性放射性数据），AUC是等离子体下的区域3.H2O（挥发性放射性）浓度 - 时间曲线表示为纳米图·小时每毫升，和D.是给药剂量（微图标）。
放射性高效液相色谱代谢物分析和后续分离鉴定及LC-MS/MS分析[3.H] -Volanesorsen样本。
使用先前报道的方法的变化提取选定的血浆，组织和尿液样品Turnpenny等人。（2011）．通常，样品在水中混合或在水中均化μ.M EDTA。液-液萃取首先加入氨水溶液，然后加入苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)。所得水提物进一步提纯，加入二氯甲烷，取水层，在离心蒸发器中干燥，在200中还原µl为50µM EDTA：5 mm TBAA，20％乙腈（1：1，v / v）。
将重构样品注射在Agilent 1200系列HPLC系统（Agilent Technologies）上，其中包括Labrogicβ-RAM（型号3; Lablogic，Tampa，FL）与Gilson FC204馏分收集器（Gilson Inc.，Middleton，Wi）生成放射码图（或放射性型材）。以1分钟的间隔收集来自无线电高效液相色谱的级分，并分配为区域（在整个运行中收集24个区域）。
使用水处理HPLC和水分泌Q-TOF Micro进行24个区域的后续代谢物同一性分析。将样品注入XBRIDGE OLIGONOCOLINE BEH C18（2.5μ.M，50×2.1 mm，130Å柱;用现象安全防护柱C18,4×3 mm保护柱（现象X Inc.），其在60℃下保持在60℃，流速为0.3ml / min。用400mm 1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇/ 15mM三乙胺和10％甲醇平衡该柱。将MS条件设定为在负模式中的电喷雾电离，毛细管电压为2.5 kV，氮500L / h的脱水气体和氮50L / h的锥气体，脱溶解温度在350℃，扫描范围为400-1500 AMU，扫描速度为1.0秒/扫描。
定量全体放射自显影。
在单一皮下剂量的[3.H] - 下列各时间点中的每一个雌性和四个雌性大鼠中，处死一只雄性和一只雌性大鼠的volanesorsen（25mg / kg），一个雄性和一只雌性大鼠：染糖剂和2,8,48和336小时。每个胴体在浴缸中被冻结N- 庚烷/固体有限公司2在约- 80°C，然后安装在羧基甲基纤维素块。血液放射性标准浓度为3.35,6.11,51.9,554和4950μ.在每个块中包括g等同物/ g，使得它们出现在每个部分中。矢状部分（30µm厚度)，在保持约−20°C的低温恒温器中准备并安装到大切片的阶段。然后将切片暴露在磷成像板下7天(存储在铅衬里盒中)，之后使用FLA5000辐射照相术系统扫描底片。使用经过验证的TINA放射性图像数据捕获软件生成图像，并使用经过验证的Seescan2密度测量软件进行量化。
相对丰富的valaneSorsen和代谢物浓度计算。
使用六条校准曲线测定血浆和尿液中的血浆和其代谢物的浓度，一个用于母体valaneSoren和5用于代谢物;选择的五种代谢产物是从3'-缺失（ISIS 489608）的19-MER，来自3'-和5'-缺失的两个10，分别为5'-缺失（分别是489609和ISIS 489610），以及两个5-来自3'-和5'-删除（ISIS 489611和ISIS 489612）的MER翅膀。每个基质中制备每个化合物的曲线以用于其各自的定量（表1)．如果代谢物没有相同的曲线，则使用具有相同最丰富的充电状态的最近代谢物的曲线作为替代。血浆和尿液样品中总寡核苷酸的浓度计算为母体活性蛋白的浓度和其定量链缩短的寡核苷酸的总和;计算相对丰度（％）作为每种寡核苷酸的浓度除以总寡核苷酸的浓度乘以100。
血浆和尿液(小鼠、猴子和人)volanesorsen的定量范围和选定代谢物校准曲线
较低的值定义为定量的下限和上限定义为定量上限。粗体和带下划线的核苷酸是2'-O-（2-甲氧基乙基）制定的。所有胞嘧啶都是5-甲基化的。
在组织中，通过将鉴定为ASOS的个体UV峰的面积与已知标准的比较，通过与已知标准的比较来估计母体AS和其代谢物的相对丰度通过所有峰的总和和乘以100。每种寡核苷酸的样品浓度低于定量限制为“0”并在计算相对丰度时被视为“0”。在任何样品中观察到的代谢产物的丰富性性别差异都没有明显明显的性别差异;因此，通过与小鼠，猴子和人的性别合并的时间点总结了血浆和尿液中这些部分的丰度。
剂量排泄百分比计算。
计算小鼠、猴子和人类尿液中母药排出的剂量百分比和所有可检测到的aso相关物种的总和。volanesorsen和所有相关代谢物的摩尔浓度是基于它们的质量浓度(毫微克每毫升)除以它们的计算分子量。每个沃拉尼森分子产生两个可变长度的翅基，其沃拉尼森当量浓度计算为摩尔浓度除以2。长度小于或等于4个碱基的代谢物由于太短而无法被检测到，这就使得这些代谢物的另一个分支的代谢物(即长度为16-19个碱基的代谢物)出现了例外，这使得它们的摩尔浓度不能除以2。沃拉尼森和每个代谢物(微摩尔)的量和每个代谢物(微摩尔)的沃拉尼森当量浓度用下列公式计算:
在哪里，AET.为24小时内排出的沃拉尼森、每个代谢物或沃拉尼森当量的量(微摩尔);C尿是血浆或氯苯的尿液浓度（纳摩尔）或valaneSorsen的单独代谢物;和V.尿为24小时收集间隔内排出的总尿量(毫升)。
每隔24小时采集一次，以鼠尿中寡核苷酸的总量(微摩尔)计算伏拉尼森与各代谢物的总量(微摩尔)之和。然后由下列表达式计算给药剂量在尿液中排泄的百分比:
在哪里，AET，E.Q。= AE.T./ 2用于代谢物15碱基长，短;AE.T，E.Q。是高达24小时的valaneSorsen-当量的量（微摩摩尔）;通过剂量（毫克）计算给药剂量（微摩尔）乘以1000并除以分子量。
结果
血浆蛋白结合
ValaneSorsen类似地对小鼠，猴子和人类的血浆蛋白相似。蛋白质结合程度在5时大于98％µG /ml, 150时略低µ在所有三种物种中，G / ml（仍然大于97％）（表2)．
小鼠、大鼠、猴子和人类的血浆药代动力学谱
小鼠、大鼠、猴子和人类单剂量和多剂量皮下注射volanesorsen的药代动力学结果均显示多相血浆浓度-时间曲线，具有快速分布相和较慢的表观消除相。选择药代动力学参数显示较低剂量，临床相关的动物研究和人体参数表3．volanesorsen的血浆浓度在小鼠0.5小时、大鼠1小时、猴子1 - 4小时和人类2-6小时达到峰值(补充图1)．
皮下注射volanesorsen不同种属的选定药代动力学参数的比较
等离子体药代动力学参数[平均值±S.D;T.马克斯小鼠和大鼠的中位值(最小-最大值)]采用稀疏采样函数非区室法计算。大鼠(3.h） - 洛丹森森研究浓度表示为每毫升莫尔氏菌属的微克当量。
在人或猴子的平均血浆中很少或没有积累C马克斯或者在重复剂量后的AUC，并且等离子体消除半衰期是相似的[猴子，12.7-36.2天;人类，11.7-31.2天（在测量的所有剂量上）]，反映了慢的代谢和来自组织的消除。显而易见的半衰期[3.H]-volanesorsen在大鼠血浆和血液中的浓度分别约为1.26和4.96天，这可能被低估，因为在消除阶段的几个浓度低于定量限度。氚标签放置于volanesorsen (图。1）是稳定的;氚交换的程度仅为剂量的1.5％（未显示数据）。当掺入2'-Moe部分修饰的寡核苷酸的间隙中时，有水面与水交换;然而，当掺入机翼时，与水的交换量大幅减少（IONIS内部数据）。
小鼠，猴子和人类的代谢物识别和定量
等离子体。
ValaneSorsen是小鼠和猴子等离子体样品中最丰富的寡核苷酸，分布阶段（1小时染色剂量）占> 96％，在小鼠的分区阶段（7天滴答）中> 63％的寡核苷酸，以及会计用于> 98％的分布阶段（2小时染色剂）和猴子的分区阶段的总寡核苷酸。与小鼠和猴子等离子体类似，ValaneSorsen是人血浆样品中的主要成分，并占分布相（4小时染色）和分区阶段的总检测到的寡核苷酸的99％。
组织。
在治疗13周(第93天)48小时后采集的小鼠肝脏和肾脏组织样本中，volanesorsen是最丰富的寡核苷酸，占总寡核苷酸的70%。在肝脏和肾脏样本中，与初始外切酶介导的代谢物(N-1到N-3代谢物，长度为17-19核苷酸)和内切酶介导的代谢物(N-5到N-14，长度为6-15核苷酸)一致的代谢物都很明显，其中N-1(或19-mer)最为丰富。紫外色谱初步分析表明样品中不存在N-15 (5-mer)代谢物;然而，当用更灵敏的方法(LC-MS/MS)检测样品时，这两种5-mers都能被检测到，尽管丰度较低。从治疗结束后13周(第93天)到恢复时间点(第182天)，外核酶和内核酶介导的代谢产物均增加。恢复13周后，volanesorsen的量下降到总寡核苷酸的<50%。
猴肝肾组织样品在治疗13周后48小时（第93天）表现出与小鼠类似的代谢谱，包括vlaneSorsen是检测到最丰富的寡核苷酸（占总寡核苷酸的82％）。在所有肝脏和肾皮层样品以及低水平的推定内切核酸酶代谢产物中，致癌的代谢物是明显的。在最后一天的治疗后13周后，量血管量减少至总寡核苷酸的48％-52％。
尿。
小鼠、猴子和人类的尿液样本都有与外核酶和内核酶介导代谢一致的代谢物。除0-24小时时间点的小鼠尿液外，所有尿液样本中与完整的沃拉尼森相比，代谢物的程度要大得多。在大多数样本中，最丰富的个体代谢物是7-mers(由3 ' -或5 ' -缺失产生)。在人类尿液中发现了两种在老鼠或猴子尿液中没有发现的代谢物，来自5 '缺失的18-甲基和来自5 '缺失的16-甲基;然而，两者都处于非常低的水平(< 24小时内排泄的总寡核苷酸的0.1%)。图2将选定的代谢谱与血浆，组织（小鼠和猴）进行比较，以及尿液跨越三种物种。
小鼠，猴子和人血浆中代谢产物相对丰度百分比的比较C马克斯和槽(A);(B)给药后48小时和末次给药后13周小鼠和猴子肝脏和肾脏(B);和小鼠、猴子和人类在单次或多次剂量后0 - 24小时的尿液，以及小鼠和猴子在多次剂量后24 - 48小时的尿液(C)。每个条代表2 - 6个测量值的平均值。误差棒是S.E.M.
排泄。
在小鼠中，在0-24和24-48小时内为80mg / kg的完整活性的平均尿液分别为60.9％和4.7％，而母体和代谢物在同一时期的总排泄为74.2％和16.3％．在猴子中，在0-24和24-48小时内为20mg / kg的平均尿液排泄分别为2.66％和1.46％，而同一时期的排泄量分别为14％和5.5％。在第22天（在近稳态）后，在前24小时内平均为5.7mg / kg（假设70公斤平均体重）平均排泄的尿液平均5.7mg / kg（假设70公斤平均体重）非常低，3.23％在400mg剂量。同期排泄量为16.5％。表4比较不同物种排泄的剂量百分比。
大鼠分布，代谢物鉴定，排泄和质量平衡
等离子体。
来自大鼠等离子体样品的放射性粗略图C马克斯（2小时染糖剂）和24小时染色剂，在5和25mg / kg剂量水平，在剂量水平的情况下定性相似，并且在2小时后，暂停唯一的主要循环放射性组分是valaneSorsen，其占64％ -71％的样品放射性。在24小时后，未完整的valaneSoren和其代谢物不能在血浆样品中呈正鉴定。
组织。
在给药后24小时，分别获得5和25 mg/kg剂量的肝脏和肾脏样本的放射性谱图。两种剂量水平的肝脏样本的放射性谱相似，只有沃拉尼索尔森是阳性的ASO，分别占低剂量和高剂量组样本放射性的56%和68%-79%。在24个区域中，放射性水平超过定量限度的区域多达14个;然而，在随后的LC-MS/MS分析中，没有能够确定代谢物。
来自肾脏样品的放射性谱在两个剂量水平之间也相似。样品放射性粗大图包含最多9个区域，其中放射性高于定量限的限制。来自低剂量组的varaneSorsen再次是主要的组分，占样品放射性的63％和59％-62％。通过肾脏样品中的MS阳性鉴定了三种代谢物，尚未附着其中的放射性标记;因此，只在随后的计算中使用这两种。仍然附着的Radiolabel的两个是从3'缺失的7-MET和3-删除的8-MER。没有放射性标记检测到的代谢物是从5'缺失的6-MER。虽然剩余的代谢物也通过肾脏中的质谱法不明，但代谢物确实在两种剂量水平下占ASO的总含量较大。
尿。
从5mg / kg（合并）和25mg / kg动物的0至6至6至24小时的大鼠尿液样品的表征从5mg / kg（合并）和25mg / kg动物效果显示出定性相似的放射性曲线（用于两次间隔和剂量水平）。主要的尿代谢物（> 10％提取物放射性）是6-MER（从3'-缺失; 26％-40％）和7-ME（从3'删除; 16％-29％）分析所有样品。在5和25mg / kg剂量下，也存在完整的ValaneSoren并占0到24小时的2.5％和10.7％。放射性粗略图有几个其他地区，这些地区差异很差，不良区域的放射性区域，而不是不同的峰，并且通常每个都占样品放射性的<5％的<5％（补充图2)．
排泄。
在施用5mg / kg剂量的动物中，在尿苷的1344小时内在排泄中回收58％的剂量，其中尿液中最大的比例（平均值为48％），恢复了8％在粪便中，另外2％的剂量在笼式洗涤中回收。放射性排泄几乎完成了1344小时，因为此时胃肠道的含量仅为0.13％的剂量。尿液排泄在0-6小时内最迅速，当回收9％的施用剂量时。在持续6-24小时后，再回收4％的剂量。此后，每天在尿液中回收1％的施用剂量直至每日收集在168小时停止。每周24小时收集从168到1344小时的收集被推断，估计每周通过尿液排出4％至5％的剂量，最长可达6周。通过尿液的每周排泄在7周内下降至剂量的3％和8周的剂量的2％。完整的ValaneSorsen在尿液中的低水平存在，占0〜24小时的剂量的0.33％。
从施用的动物的0-24小时收集期的放射性回收来自施用的较高（25mg / kg）剂量的剂量为20.04％-23.82％，其中几乎所有尿液都在尿液中（仅0.48％-0.97剂量的百分比在粪便中）。尿液中也存在完整的vlaneSorsen，含量为1.34％-2.09％（表4)．
定量全体放射自显影。
我们测定了雄性和雌性大鼠全身定量放射自显影后2、8、48和336小时的组织放射性浓度图3.．血浆浓度低于2和8小时的相应血值，但在48和336小时的时间内保持可测量。与皮下给药途径一致，在剂量注射部位观察到高水平的放射性。除了剂量部位外，肾脏含有最高浓度的放射性，其次是肝脏，该肝脏在持续48小时内达到其最大浓度。正如预期的那样，由于ASO无法穿过血脑屏障，大脑和脊髓在所有时间点都没有放射性。
通过定量全身放射性放射性浓度在单一皮下施用后通过定量全身放射造影3.H] - 在25mg / kg的雄性大鼠（每时间一方的一只动物）。
讨论
在物种中彻底研究了vlaneSorsen的药代动力学和代谢。在所有物种中，VolaneSorsen证明了剂量依赖性和多相等离子体浓度 - 时间曲线，具有快速分布相和较慢的消除阶段。等离子体几乎没有或没有积累C马克斯或AUC重复剂量后，血浆消除半衰期（猴子和人类2-4周），反映了慢的代谢和从组织中消除。大鼠的半衰期短（1-5天）是由于单剂量给药后消除阶段中的定量限制的几种浓度而低估。
与其他2'-Moe部分修饰的ASO一样，vlaneSorsen在小鼠，大鼠和猴子之间具有相似的组织分布特性，肝脏和肾脏的最高浓度（（Geary等，2003年;Levin等人，2007年;Yu et al.， 2015）））。通常认为ASOS通过受体介导的内吞作用分配到组织中（Croke等人。，2017年)而不是被动扩散。内吞细胞摄取可能被认为是主要的单向的，事实上，在临床前物种和人类中通常观察到很大的组织-血浆浓度梯度(~ 5000:1)。齿轮，2009年;Geary等人。，2015年;Wang等人。，2018年)．ASO返回血浆的缓慢分布可以与细胞周转（细胞死亡）或从组织中的等离子体的可逆分配的非常缓慢的速率相关。有必要进一步研究以更好地了解ASO化学，细胞类型和周转，以及血浆和组织蛋白质对ASOS组织吸收的影响。
2 ' - moe部分修饰的ASOs在组织中被核酸酶缓慢代谢，主要是通过脱氧磷酸硫酸间隙内不同位置的内切酶水解，随后形成的代谢物暴露的脱氧核苷末端的3 ' -和5 ' -外切酶水解(图4)．在等离子体中，通过肾脏中的肾小球过滤清除未结合（和低结合）链缩短的寡核苷酸代谢物和任何剩余的残余未结合的未结合（高结合）母体药物，其中母体ASO大部分由肾近端小管重新破压剂量低（摄取在线性范围内），作为肾脏代谢的部位(吉尔里et al。，2003年;yu.et al。，2007）．
valaneSorsen广泛地分发肝肾组织。在猴子（类似于300mg临床剂量）的4mg / kg的剂量时，肾皮质中的valaneorsen暴露量比肝脏高约50％。尽管如此，在肾皮层和肝脏之间观察到最后剂量的VilaneSorsen之后的平行消除阶段。两种组织之间观察到类似的相对比例的ASO代谢物，表明肝脏和肾脏在ASO代谢中的等同作用。
第二代ASOS的代谢生物转化和排泄途径。
两者都研究了Valanesorsen的代谢3.h -辐射标记的大鼠ADME研究和小鼠和猴子的非标记研究。从大鼠ADME研究中获得的结构信息的缺乏可能是由于只有一次给药(而不是多次给药)和样本清理不足。本研究的初始提取方法采用最小加工工艺，以提高代谢物绝对回收率。基质的增加是预料到的，并计划通过在线清洗，即通过放射性高效液相色谱的分馏。然而，许多基质与许多代谢物(尤其是较短的代谢物)共腔，无法进一步处理，导致基质效应导致信号抑制。因此，尽管在ADME研究中使用放射性标记的ASO有很多好处，但显然，使用单剂量研究来检查广泛分布于代谢发生组织的化合物的代谢可能并不理想。研究设计应更多地反映药物将在临床使用的方式。然而，整体的组织图谱评估显示了三种物种之间的相似性，预计在人体组织提取物中也会有类似的观察结果。
在评估物种中尿液中母体药物的相对丰度似乎与施用的剂量，80mg / kg，猴子20mg / kg，400mg（5.7mg / kg）中的剂量有关。较高的毫克/千克剂量导致尿液中母体药物的更大的相对丰度可能归因于血浆或较少的vlaneSorsen中的血浆或更少的vlaneSorsen在近端小管中以较高剂量水平的血浆或更少的级数。在小鼠，猴子和稳态的24小时后尿液中尿液中消除的药物相关部分的总比例通常与尿液消除是部分2'-MOE改性ASOS的主要排泄途径一致。相关代谢物。
值得注意的是，尿液中血管血管的代谢概况与其他部分2'-MOE改性的ASOS报告的内容有所不同。在以前的非二元标记尿代谢研究中，没有检测到六个碱基，也没有从15至19个碱基碱基，而在这项研究中发现了所有代谢物。虽然较长的ASO代谢物的丰度非常低，但是5-和6-MERS的浓度非常高。这种差异很可能不是由于先前ASO和valaneSoren之间的代谢差异，而是由于改进的提取方法（IONIS内部数据）。先前的报告使用了两步，固相提取（强阴离子交换，然后是C18），这导致非常低，绝对恢复短代谢物（五到七个碱基）。本报告中使用的方法对于长度为5至20个基数的ASO具有更高的绝对恢复，并且能够比以前更好地捕获整个代谢概况(吉尔里et al。，2003年;yu.et al。，2007）．利用这些较旧的提取方法尿液中先前报道的尿液中先前报道的总恢复导致了实际值的低估。通过这些改进的方法，我们能够产生大规模平衡数据，显示在24小时后施用的剂量施用的剂量约16.5％的恢复，这将导致施用剂量的完全恢复，假设其他6天中的每一个相同的排泄每周剂量间隔（考虑到组织中ASO的长半衰期的合理假设）。
尽管提取方法改善，但LC-MS / MS仍有限制，以实现在治疗相关剂量的治疗方法中检测和定量母体ASO和代谢物的所需敏感性。最近审查了ASOS及其代谢物的定量（Kaczmarkiewicz等。，2019年）虽然在本申请中存在许多进展，但它仍然是一种复杂的多变量问题，可以使得能够实现所需的定量下限（特别是对于代谢物通常<1ng / ml的低谷等离子体浓度）．有趣的是，大多数公开的方法使用对其MS检测的多重反应监测和产生大充电状态分布的离子对。这里采用的策略是使用离子对TBAA在扫描模式下采用窄充电状态分布并操作MS，导致代谢物信号的增加，以牺牲全长一个。这种妥协使我们能够在一次运行中将每个代谢物从5到19个基础上表征。
携带在一起，vlaneSorsen的Adme特征在调查的物种中类似，与同一化学类别的其他ASO的报告一致（纪念et al。，2003年那2015年那yu.et al。，2007年那2013年)．最终，这些发现与volanesorsen代谢的主要模式一致，即首先在母体化合物中心间隙内的各个位置内切酶介导的水解，然后在形成的代谢物的脱氧核苷末端外切酶(3 '和5 ')介导的水解。此外，这项研究还提供了与所有与沃拉尼森相关的部分的主要消除途径是尿液排泄一致的结果。
致谢
作者感谢Shannon Hall和Christine Hoffmaster为追踪完成稿件，斯科特亨利的支持和批判性评审所需的基本信息，以及Wanda Sullivan进行行政援助。
作者的贡献
参加了研究设计：帖子,Yu,王。
进行实验:邮政。
执行数据分析：帖子，俞。
写入或促成了稿件的写作：邮政，余，格林利，Gaus，Hurh，Matson，王。
脚注
- 收到了2019年4月2日。
- 公认2019年7月24日。
N.P.，R.Y.，S.G.，H.G.，J.M.和Y.W.是Ionis Pharmaceuticals，Inc。的员工和股票持有者。是akcea治疗剂的员工和股票持有者。
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本文有补充材料可用www.1zgc.com.．
缩写
- adm
- 吸收，分布，新陈代谢和排泄
- Apoc3.
- 载脂蛋白C-III
- aso.
- 反义寡核苷酸
- AUC
- 曲线下的区域
- LC-MS / MS
- 液相色谱 - 串联质谱法
- 2'-moe.
- 2'-O.——(2-methoxyethyl)
- 女士
- 质谱分析
- TBAA.
- 醋酸二甲酰基铵
- 版权所有©2019由作者
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![Concentrations of radioactivity in tissues by quantitative whole-body autoradiography following a single subcutaneous administration of [3H]-volanesorsen at 25 mg/kg to male rats (one animal per time point).](http://www.1zgc.com/content/dmd/47/10/1164/F3.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
