抽象的
SLCO1B1（溶质载体有机阴离子转运家族成员1B1）是一种重要的跨膜肝摄取转运蛋白。遗传变异SLCO1B1基因与改变蛋白质折叠，导致蛋白质降解和降低转运蛋白活性有关。下一代药物基因测序(NGS)正越来越多地应用于将药物反应的变异与基因序列变异联系起来。然而，使用“一次一个”功能系统很难将意义未知的变异与功能表型联系起来。深度突变扫描(DMS)是一种高通量技术，采用“基于着落单元的系统”，以并行和可扩展的方式分析数百种基因开放阅读框(ORF)错义变体。我们应用DMS分析了137个错义变异SLCO1B1从外显子组聚合联盟项目中获得的ORF。含有这些变异的orf与绿色荧光蛋白融合，并整合到“着陆台”细胞中。采用荧光激活细胞分选，根据单细胞水平上蛋白表达的荧光读数将细胞分为四组。然后进行NGSSLCO1B1变异频率用来测定蛋白质丰度。我们发现，6个以前未被描述的变异显示不到25%的功能，另外12个显示大约50%的野生型蛋白表达。这些结果随后由转运体研究进行功能验证。经DMS鉴定的严重损伤变异可能具有临床意义SLCO1B1 -依赖的药物运输，但我们需要谨慎行事，因为相对较少的严重破坏性变体识别出在诸如有机阴离子转运蛋白1b1等内在膜蛋白的施用中提出了问题。
意义陈述尚未表征转运物基因中大量开放阅读框（ORF）“（VUS）的大量开放阅读框（ORF）”变体“的功能影响。本研究应用了深度突变扫描，以确定在ORF中观察到的VUS的功能效果SLCO1B1（S.溶质载体有机阴离子转运家族成员1B1）.确定，研究和验证了几种严重破坏性变种。这些观察结果对深度突变扫描到内在膜蛋白的应用以及药物和内源化合物的临床效果具有影响SLCO1B1．
介绍
这SLCO1B1（溶质载体有机阴离子转运蛋白成员1b1）基因编码跨膜有机阴离子转运蛋白1b1（oatp1b1），其运输内源化合物，如17-β-Glucuronosyl雌二醇和胆红素以及药物如他汀类药物和某些口服抗糖尿病药剂（北村等，2008;Van de Steeg等人。，2013年）.转运蛋白基因内或附近的遗传多态性可能导致转运蛋白促进药物摄取的大量变化（Niemi，2010年;Oshiro等人，2010年）.例如，SLCO1B1 * 5错义变体(rs4149056)与他汀类药物(如辛伐他汀)的血浆清除率降低相关，可导致他汀诱导的肌病(Giacomini等人。，2013年）.该相同的变体与增加的血浆缀合物的血浆浓度增加有关（Dudenkov等，2017年;莫耶等人，2018）.与…相关的功能减少的机制SLCO1B1 * 5如先前研究报告的，可以与其易位的交替有关（Kameyama等，2005年;Voora等人，2009年）.梅奥诊所最近完成了RIGHT 10K药物基因组学研究，在该研究中，对来自1万多名梅奥诊所生物库参与者的DNA进行了下一代测序(NGS)，以确定77种药物基因的变异，包括SLCO1B1，为了研究这些基因中药物变异性的临床意义（Bielinski等人，2014那2020.）.基于Broad Institute的Exome聚合财团具有60,706个不同祖先个人的Exome测序数据（Lek等人。，2016年）.大多数这些科目的变种观察是意义不明（VUS）的变种。大多数VUS，不像常见的药物基因变种，是不太频繁或罕见的，所以他们将在临床实践中只是偶尔观察到，但一旦发生，其后果可能是非常有临床意义。因此，高通量测定中的应用，开始确定的过程，所述的变体可能具有功能的影响表示在实际临床应用方面向前迈进了一显著步骤。
深度突变扫描(DMS)是一种技术，它提供了一个平台，可以并行查询大量的错义变体，使其比传统的“一次一个变体”方法更高效(Matreyek等人。，2017年）.最近，我们在功能上表征230CYP2C9和CYP2C19使用DMS登陆焊盘系统的密码变体。在那些研究期间，我们识别并用作验证了一系列严重破坏性的变种（Zhang et al.， 2020）.福勒的集团，在这一领域的先驱，杨的集团使用了这款着陆垫系统来研究一系列重要蛋白质的功能TPMT.（T.Hiopurine S-甲基转移酶），PTEN（P.磷酸酶和张力蛋白同系物),NUDT15（Nudix水解酶15），所有这些主要位于细胞溶胶中（Matreyek等人。，2018年;Suiter等人，2020年）.虽然OATP1B1转运体是一种固有的膜蛋白，但调节转运体活性的机制之一涉及由于溶酶体介导或其他蛋白质降解机制导致的蛋白表达变化(Alam等，2016年）.我们还应注意DMS的有限适用性，以通过其他机制（例如导致亚细胞定位或翻译后调节）的其他机制导致功能丧失功能的密码变体的研究。
在目前的研究中，我们开始分析错义变体的功能含义，已经观察到SLCO1B1开放阅读框（ORF）。我们分析了在该基因的ORF中观察到的137名麦克信变体（Lek等人。，2016年）.具体而言，我们包括exome聚合联盟报告的遗传变异（MAFS）> 0.00001，如梅奥右10K项目观察到的新型ORF VU。
我们发现137中的6个SLCO1B1我们所研究的麦克信变体显示出小于约25％的野生型（WT）蛋白表达，一种可能显着降低运输蛋白活动的水平。我们还将DMS确定的变体功能信息与计算算法的预测进行了比较了DMS，最后，我们通过Western印迹分析和运输研究的使用而发现，发现验证的变体受到严重破坏。我们的研究结果表明，DMS可以是鉴定低蛋白质丰度ORF VUS的高通量方法，这可能对药物运输潜在的临床意义。然而，他们还表明，谨慎将在解释这种类型的内在膜蛋白如oatp1b1的情况下进行谨慎。
材料和方法
生成DMS变体库。
预先产生具有单个着陆垫的着陆垫单元线克隆＃20以集成SLCO1B1表达式盒，和SLCO1B1如先前所描述promotorless盒被吉布森组件产生（Zhang et al.， 2020）.通过使用BXB1重组酶集成了促进剂盒上的连接位点和着陆垫克隆＃20上的质粒附着点。人类SLCO1B1ORF cDNA质粒从Genscript（Piscataway，NJ）获得。切屑诱变方法被修改Wrenbeck等。（2016）构建包含的ORF的变体库SLCO1B1错义突变。磷酸化的寡核苷酸SLCO1B1改型从IDT (Coralville, IW)购买。采用Sanger测序法对变异克隆进行序列验证。
细胞培养和质粒转染。
HEK293T细胞在Dulbecco的改性鹰培养基中培养，其补充有10％FBS，100μg/ ml青霉素和0.1mg / ml链霉素。着陆垫细胞的长期通道使用上述培养基与2μg/ ml doxycline（Sigma-Aldrich，St.Louis，Mo）使用。通过转染添加BXB1重组酶前1天除去十二胞环素培养基。表达载体pcAg-nls-ha-bxb1（＃51271; addgene）用于表达使用5×10的质粒DNA进行的变体文库的整合的BXB1重组酶介导的整合5.用6µl Fugene6 (Promega, Fitchburg, WI)在六孔板中转染3µg质粒DNA。
Fluorescence-Activated细胞排序。
促进者SLCO1B1具有附着位点的质粒，如图所示图。1A将重组酶BXB1转染后24小时转染到着陆垫克隆＃20后24小时转染。通过十二胞环素诱导着陆垫细胞中蓝色荧光蛋白（BFP）的表达。5天后，胰蛋白酶化克隆，用PBS洗涤，并在4℃下在4％甲醛中固定10分钟。通过流式细胞仪FACS Cantox（BD Biosciences，San Jose，CA）和使用Facsdiva版本8.0软件和FlowJo软件版本10（BD Biosciences）分析细胞。FACS Cantox仪器利用CLINEAR 405,488和561 NM激光器加上向前和侧角光散射。洗涤库细胞，胰蛋白酶化，并重新悬浮在含有5％FBS的PBS中。然后使用具有407,488和532nm激光（BD Biosciences）的体积分红的细胞分选到四个箱中，并在培养基中收集细胞。BFP.-/麦克里+细胞包含SLCO1B1变种被流分类并生长5天。BFP.-/麦克里+再次对细胞进行分类以确定蛋白质表达SLCO1B1根据他们的GFP / mCherry的变种的比例。盖茨是基于GFP / mCherry的比率设定用于集成已知细胞SLCO1B1变体和WT蛋白作为门控参考。将四个门设置为基于GFP / MCHERRY比将汇总的文库分解为四个不同的箱子。BACSDIVA 8.0.1软件分析了数据。
流式细胞仪SLCO1B1已知变种和FACS结构的汇集SLCO1B1变体图书馆。（a）SLCO1B1表达式盒子示意性地描绘。当该载体集成到HEK293细胞中的“着陆垫”中时，它导致重组蛋白的表达，其标记为标记标记的标记SLCO1B1，而电池本身将表达的mCherry，所以GFP的到的mCherry的比率作为所表达的蛋白质，即的稳定性的指示，就越高比，更稳定的由表达的变体编码的蛋白质。这SLCO1B1表达盒通过attB和attP重组整合到着陆台上。(B、C) BFP的流式细胞术分析-/ mCherrry+具有集成的野生型或已知损伤变体的细胞，例如SLCO1B1 * 2．值得注意的是，对于WT蛋白，大多数细胞的GFP/mCherry比率较高，而含有损伤变异体的细胞的GFP/mCherry比率明显低于表达WT的细胞。这些变异体的平均GFP/mCherry比率与我们之前研究中获得的Western blot结果一致。(D)细胞融合SLCO1B1池化的变体库根据GFP/mCherry比率被分类到四个箱子中。这些变异被分为三组:严重破坏性变异属于第1类，破坏性变异属于第2类和第3类，耐受变异属于第4类。门是基于WT设置的SLCO1B1和SLCO1B1*2．收集每个垃圾箱中的分选细胞的池，并用作随后扩增子DNA测序的输入材料。Ha-L，左侧臂;Ha-R，正确的同源臂;IRES，内部核糖体入口部位。
测序库的准备和测序。
扩增子的SLCO1B1使用KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, Wilmington, MA)从250 ng基因组DNA中扩增。设计引物结合常见的非突变区盒式序列。聚合酶链反应产物用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen, Germany)纯化，用Qubit dsDNA HS Reagent (Fisher Scientific, Hampton, NH)定量。以扩增子DNA (1 ng)为起始材料，使用Nextera XT DNA制备试剂盒(Illumina, San Diego, CA)制备文库。条形码适配器(Genewiz, South Plainfield, NJ)用于文库制备，标度后收集样本，使用Illumina HiSeq4000测序系统在快速运行模式下进行测序，使用TruSeq rapid SBS Kit (Illumina)，具有300周期和2 × 150 bp对端读取能力。文件对齐到SLCO1B1参考序列。
变体调用。
fastq文件与SLCO1B1引用序列使用Burrows-Wheeler对准器版本0.7.15。Samtools mpileup版本1.5与自定义Python脚本一起使用，用于单个核苷酸变体的调用。对单核苷酸变异呼叫采用基础质量分界点20和作图质量分界点20。使用自定义脚本总结数据，并添加参考序列中所有位置的每个碱基的等位基因频率(补充脚本1）.
蛋糕。
BFP.-/麦克里+含有个体的细胞SLCO1B1在转移到聚偏二氟化乙烯（PVDF）膜之前，通过SDS-PEP分离变体，蛋白质通过SDS-PEP分离。将膜与兔多克隆孵育OATP1B1针对对应于人的重组片段的抗体OATP1B1aa426-537。1000稀释度在1;（。Abcam公司目录号ab224610）。mCherry的蛋白使用小鼠单克隆抗体mCherry的以1测定：2000稀释液（目录编号SAB2702291; Sigma）和用作上样对照的表达。使用的SuperSignal西杜拉持续时间延长底物（Thermo Scientific，沃尔瑟姆，MA）检测蛋白质和蛋白质印迹图被使用ChemiDoc触摸成像系统（Bio-Rad公司，大力士，CA）的拍摄。
运输车测定。
放射性标记的雌二醇17-β-D.葡糖苷酸(Estradiol-6 7 -3.H（n）] 51.5 CI / MMOL（PerkinElmer，波士顿，MA）用于测量该化合物的摄取SLCO1B1运输器变体。具体来说，BFP.-/麦克里+细胞以4 × 10的密度播种5.24孔板上的每孔细胞，并生长至汇合24小时（Van de Steeg等人。，2013年）.在实验开始前，将细胞用预热的Hanks’平衡盐溶液（HBSS）/ HEPES（pH 7.4）中洗涤两次，并用增加的浓度温育3.H] - 标记的17-雌二醇β-D.-glucuronide，范围为1.5到48 nM, 1分钟。我们使用的最高浓度高于生理范围，但此浓度范围用于体外摄取研究(Parvez et al.， 2016）.摄取物通过用0.4毫升冰冷的HBSS / HEPES + 0.5％牛血清用0.4毫升冰冷的HBSS / HEPES洗涤细胞白蛋白和两次终止，接着加入200μlM-PER缓冲器每孔（Thermo Scientific的）.所述细胞裂解物（150微升）中的溶液转移到5毫升的塑料闪烁小瓶的放射性通过液体闪烁计数（Beckman Coulter公司，印第安纳波利斯，IN）进行测量。使用Bradford方法（BioRad）上，测定每个样品的蛋白浓度。放射性标记的雌二醇的量17-β-D.通过使用液体闪烁计数测定细胞内积聚的葡糖苷。数据以毫克蛋白质含量标准化的每分钟计数（CPM）表达。
结果
一代的SLCO1B1变体图书馆。
我们使用高通量DMS系统研究137的蛋白表达SLCO1B1错义突变。DMS系统包括一个着陆台细胞系和无启动子SLCO1B1盒子。在这些研究中使用着陆垫单元线克隆＃20，如我们以前的出版物（Zhang et al.， 2020）.简而言之，使用HEK293T细胞产生这种着陆垫细胞系，该细胞已据报道具有次级酮核素型。因此，我们筛选了不同的克隆，并使用着陆垫的一个副本找到了克隆＃20，使我们能够集成一个单一的副本SLCO1B1每个单元的变异(Zhang et al.， 2020）.一个promotorlessSLCO1B1盒式磁带被构造成包括的SLCO1B1ORF序列和ORF的C末端被与GFP融合，以指示蛋白表达（图。1A）.在内部核糖体进入部位（IRES）组分之后表示MCHERRY，其用作转染的对照。一旦SLCO1B1ORF盒通过使用BXB1重组酶降落在着陆垫上，登陆垫细胞中的BFP被破坏，BFP-/麦克里+收集细胞用于在随后的实验中进行的流式细胞术或荧光活性细胞分选（FACS）分析。GFP / MCHERRY比例用作指示器SLCO1B1DMS系统中的蛋白质表达。早期的研究（Tirona等，2001年），单独使用Western Blotting表明了SLCO1B1*2(rs56101265)变异等位基因影响最终转运蛋白数量。为SLCO1B1*2，平均GFP/mCherry比值为野生型GFP/mCherry比值的61.5%，与Western blot结果吻合较好蒂罗纳等。（2001）(见图。1B）.这些结果作为后续实验的流式细胞仪门控对照。具体地说，我们用缺口突变技术创造了137SLCO1B1MAF的密码变体高于Exome聚合财团和Mayo Clinic Right 10K项目的0.001％。汇集SLCO1B1变异表达磁带被整合到着陆台克隆#20中。下一步，我们使用已知的破坏性SLCO1B1 * 2变量与WT一起SLCO1B1构建作为参考，以建立FACS门控。具体来说，这SLCO1B1基于GFP / MCHERRY比的值将变体文库分成四种不同的“垃圾箱”，这是每个变体的蛋白质表达的指标，即，比率越高，表达的蛋白质丰富越多SLCO1B1变体(图1C.）.我们使用三种类型的变体分类 - “严重损害”，在箱1的变体，“损害”，在箱2和3的变体，或“耐受性”在仓流式细胞术验证的基础4-上变体（图1中，C和d）.DMS系统，如图。1，这使得我们能够确定由含有VUS的结构体编码的每个变异蛋白的表达量。
的影响SLCO1B1蛋白质水平的变体。
BFP的池-/麦克里+表达细胞SLCO1B1如图所示，通过四向FACS对密码变体进行排序图。1D．从每个容器中收集的细胞中提取DNA，然后进行NGS扩增子测序。每个容器中每个变体的变体频率由自定义脚本调用(见补充脚本1）.每一项的丰度得分SLCO1B1使用以下等式确定单独的变型，其中fv =变体频率SLCO1B1每个容器中的变体:
通过将来自0.25到1的加权值乘以跨越四个垃圾箱来计算每个变型的“丰度得分”，并根据蛋白质表达的百分比与wt（福勒和领域，2014年;Matreyek等人。，2017年那2018年;Zhang et al.， 2020）.每个个体变异的平均丰度评分是基于至少三个独立的重复试验计算的。丰度得分为SLCO1B1中图形化显示的变体图2而在补充图1和补充表1．“严重破坏”变种落入垃圾箱1，“损坏”变种落入箱2和箱3，并在流式细胞仪结果的基础上，“耐受”变体落入箱4。具体而言，“严重破坏”SLCO1B1与WT相比，变体具有大约25％的蛋白质表达或更少，具有小于0.5768的丰度得分（SLCO1B1 b * 1388A>G, rs2306283)，而丰度评分等于或高于该阈值但低于0.6015的变异(SLCO1B1 * 271200℃> G，RS59113707被认为是“破坏”，表达约50％的oatp1b1 wt蛋白丰度。因此，SLCO1B1具有高于0.6015的丰富分数的变体被分类为“耐受”（图2）.总之，我们在荧光读出进行了将细胞分离为四个垃圾箱。然后，使用每个垃圾箱中DNA的扩增子测序，然后用于每个箱中的变体频率的计算分析，以确定水平OATP1B1表达式用于构造表达式每个VUS (图3.）.我们观察了六次严重破坏SLCO1B1由由来自变体频率计算的丰富分数确定的变体（1462g> A，1246g> A，215g> A，1508A> G 1828C> T和1296C> A）。
蛋白质丰度得分为137SLCO1B1变体。具有丰度分数小于或等于0.5728的变异SLCO1B1（1296C> A）被归类为“严重破坏”变体，而丰富分数的变体等于或高于0.5768（SLCO1B1 b * 1， 388A>G, rs2306283)但小于0.6015 (SLCO1B1 * 27，1200℃> G，RS59113707）被归类为“破坏”。具有高于0.6015的丰富评分的变体被归类为“耐受”。所示结果是四个重复的平均分数。S.D.列出了值补充表1．
用于六个新识别的“严重”损伤变体（1462g> a，1246g> a，215g> a，1508a> g 1828c> t和1296c> a）的变体频率SLCO1B1，它们分为四个箱中的每一个，以及相同的类似数据SLCO1B1*5.等位基因。
使用DMS，变体呼叫结果为137SLCO1B1变异(MAF > 0.00001)从外显子组聚合联盟浏览器(目前的gnomAD数据库)和SLCO1B1来自Mayo右10K研究的变体也按照DMS的变异分类顺序列出表格1．此外，我们使用SIFT(从耐受到不耐受)、Provean、Polyphen2和CADD(组合注释依赖缺失)将DMS结果与其他预测算法进行了比较，发现了两个严重破坏性变异(215G>A和1296C>A)和八个破坏性变异(388A>G、1200C>G、671T>A、1015G>C、235C>T、38C>A、991A>G、和154A>G)，被DMS方法识别，被四种算法之一遗漏。这些结果列在补充表3.．我们还搜索了PharmVAR，该数据库包括在其他信息中，包括药物发生序列变异对药物反应的可能影响，但数据库不包括这些变体功能的报告（Gaedigk等，2018年）.显示的六种严重损坏的变体之一图3.那SLCO1B1C.1296C> A，RS534931824，MAF为0.01％，也可能提供临床有用的信息。
功能的验证SLCO1B1严重损害变体。
接下来，我们试图通过功能研究来确认我们通过DMS识别的严重破坏性变异的结果。我们通过Western blot分析验证了这些新鉴定的严重损伤变异(1462G>A、1246G>A、215G>A、1508A>G、1828C>T和1296C>A)的蛋白表达数据。结果显示在图4A．六种变体SLCO1B1预测损伤严重时显示的蛋白表达量小于25%OATP1B1WT蛋白质。SLCO1B1*2和SLCO1B1 * 5也被研究为比较器。最后，我们进行了转运剂测定以确定这些新发现的严重破坏性变种的转运蛋白活动。与通过放射性17-雌二醇摄取测量的WT蛋白相比，通过严重破坏性变体的运输显着降低β-D.-glucuronide，一种用于运输的原型底物SLCO1B1．的浓度17-estradiolβ-D.- 通过严重破坏变种和wt的葡萄糖醛植物吸收OATP1B1蛋白质显示在图形中图4B.．所有六种新识别的功能SLCO1B1变体显示出显着降低的转运蛋白活动，如图所示图4B.通过条形图图4C.，它描述了在放射性17-雌二醇的最佳浓度下运输减少的水平β-D.葡糖苷酸。变异体的蛋白质降解是一种常见的机制，通过错义变异体可以改变蛋白质的丰度，并因此改变转运功能。然而，也有一些例子表明转运蛋白的改变与转运蛋白数量的变化明显无关。例如,SLCO1B1 * 5显示出wt样蛋白丰度，但与转运蛋白活性降低有关。与…相关的功能减少的机制SLCO1B1 * 5可能与先前报道的其转位到细胞膜的变化有关(Kameyama等，2005年;Voora等人，2009年）.氨基酸被改变了* 5.变量映射到SLCO1B1因此，我们也研究了一个原型的运输SLCO1B1我们研究的8个额外的变体映射到相同的跨膜结构域。我们发现，在具有wt样丰度评分的8个变异中，有6个表现出正常甚至较高的运输能力，但有2个(SLCO1B1如图529G> C和560C> T）显示出相对减少的运输能力，如图所示图4D通过条形图图4E.，描述了24nm放射性17-雌二醇中转运体的活性β-D.葡糖苷酸。这些观察结果表明，TM4中的这些额外的两种变体也可能表现出障碍的运输SLCO1B1 * 5。此外，两个变体（SLCO1B1508A>T和577C>T)与WT相比活性显著增加，通过单因素方差分析进行统计检验P.<0.05，如图所示图4E.．
的验证SLCO1B1鉴定为含有严重破坏性变体的变体。（a）Western印迹验证SLCO1B1鉴定为含有严重破坏性变体的变体。蛋白质表达SLCO1B1在BFP.-/麦克里+通过Western印迹分析验证整合严重破坏性变体的细胞。MCHERRY用作装载控制。控制车道包含wtSLCO1B1．（b）浓度依赖于雌二醇17-β-D.由葡萄糖醛酸苷SLCO1B1WT BFP.-/麦克里+细胞和6个新发现的严重损伤SLCO1B1变体BFP.-/麦克里+细胞孵育1分钟后。放射性标记的雌二醇17-β-D.氨尿苷是通过液体闪烁计数测定细胞内的葡萄糖胺。数据以毫克中的蛋白质含量归一化的CPM表示。数据显示为三种复制实验的平均摄取。（c）条形图显示了雌二醇17-β-D.-glucuronide (24 nM)的变异SLCO1B1TM4在BFP中-/麦克里+细胞孵育1分钟后。用单因素方差分析检测WT严重损伤变异对变异的吸收活性;＊＊＊＊P.<0.0001。（d）浓度依赖于雌二醇17-β-D.-Glucuronide用于变体SLCO1B1TM4在BFP中-/麦克里+细胞孵育1分钟后。数据显示为平均值±S.D.每镁蛋白的CPM为三个复制实验。（e）条形图显示雌二醇17-β-D.-glucuronide (24 nM)的变异SLCO1B1TM4在BFP中-/麦克里+细胞孵育1分钟后。通过单向ANOVA测试TM4对WT的变体的摄取活性;*P.<0.05;＊＊＊＊P.<0.0001。
讨论
对临床相关数量有限的功能研究SLCO1B1药物转运体变异，应用了“一次一个”的系统，这是劳动密集型和需要耗时的分析。在本研究中，我们使用DMS着陆台平台从功能上描述了自然发生的ORF错义变体SLCO1B1以高通量方式(福勒和领域，2014年;Matreyek等人。，2017年那2018年;Zhang et al.， 2020）.带有单个着陆垫的着陆垫细胞系克隆＃20用于以高吞吐量的方式筛选变体蛋白表达（Zhang et al.， 2020）.错义突变的SLCO1B1由于蛋白酶体或溶酶体介导的降解导致蛋白质表达改变，其主要机制负责药物替补变体的蛋白质表达减少（Wang等人。，2004年;Alam等，2016年;Matreyek等人。，2018年;Suiter等人，2020年;Zhang et al.， 2020）.包含非同义的变异体失去功能SLCO1B1ORF由于蛋白质表达减少而导致的单核苷酸多态性使我们可以通过使用荧光报告分析来分析该功能。FACS用于分离与不同蛋白质表达水平相关的变体，随后通过NGS识别，使得可以计算每个变体的频率。我们选择学习聚焦的变体图书馆，即包括高于特定水平的自然发生水平而不是使用饱和突变库的图书馆SLCO1B1错义突变。具体地，我们分析了137个非同义ORF变异SLCO1B1来自Exome聚合的联盟研究，MAF> 0.00001（见）图2）（Lek等人。，2016年）.我们验证了造成严重破坏性变体的运输活动，而这些结果与蛋白质表达水平吻合良好，如图所示图4A．的晶体结构SLCO1B1尚未报告，但已识别12个跨膜域OATP1B1转运蛋白序列(洪等人，2010）.六个新鉴定的严重破坏的变体四（1462G> A，1508A> G，1828C> T，1296C> A）分别位于细胞外结构域和两个变体（1246G> A，215G> A）分别位于跨膜结构域。在关于硅片预测如何损害个体变异可能并不总是与我们的DMS结果一致，如图补充表3.，之前的出版物表明蛋白质表达减少SLCO1B1变体只是可能导致功能受损的机制之一（Kameyama等，2005年）.显然，蛋白质包括SLCO1B1非纯变体可以显示加入的转运蛋白活性降低的WT样蛋白质丰度。这一事实被戏剧性的时尚强调SLCO1B1*5.，其转运蛋白活性明显降低，蛋白水平与WT相似SLCO1B1．该研究中包含的变体列表包括八个变体，其映射到编码TM4的基因序列，该域包括SLCO1B1*5.．大多数TM4变体显示出WT样或更高水平的运输，但八个中的两个均显示出来减少（见图4C.）.使用DMS进行研究的一个可能的限制OATP1B1和其他内在膜蛋白可能与这样的事实：为功能丧失或活性降低这些蛋白质的机制可以由我们所申请即。，蛋白表达测定法的类型被错过。在硅片预测已被广泛应用于预测具有用于药物作用药物基因组学等方面的影响（蛋白质功能的变化Flanagan等人，2010年;Kircher等人，2014;Choi和Chan，2015;Vaser等人。，2016年）.我们以前的工作以及其他工作支持应用各种功能方法的重要性，以验证通过使用预测算法获得的结果。因此，我们将通过使用DMS与计算算法的预测进行比较呼叫变体功能，并且在我们的结果和预测算法之间发现了显着的差异，可能是由于负责的底层分子机制而导致的差异SLOC1B1如上所列功能减少补充表3.．
根据我们的结果和其他团体的经验，DMS似乎是胞质蛋白，如研究中的一个有用的和敏感的方法TPMT.（硫嘌呤S-甲基转移酶），PTEN（磷酸酶和张力蛋白同源物),NUDT15（Nudix水解酶15.）和内质网蛋白如CYP2C9和CYP2C19，其中丧失功能的主要机制是蛋白质降解，在这种情况下，预期损伤变体的损失型变体将显示出从WT样变体（Wang等人。，2005年;李等人。，2008年;Matreyek等人。，2018年;Devarajan等，2019年;Suiter等人，2020年）.遗传变异的功能含义改变氨基酸序列的遗传变异SLCO1B1基因显然是一种涉及多种机制的复杂方法，其可包括质膜定位和整合，蛋白质降解和转录和翻译后变异的变化（Alam等，2016年那2018年）.对于内在的跨膜蛋白OATP1B1，DMS可以是预测改变所需的一系列方法之一SLCO1B1功能。
总之，我们已识别并验证了六个SLCO1B1在Pharmvar之前未报告的严重破坏性变体。如果它们可以与药物响应表型或疾病病理生理学中的个体变异相关，这些变体在临床上是潜在的可操作性的。我们发现显示蛋白质表达减少的变体的功能研究支持DMS预测的功能后果。
作者的贡献
参加了研究设计：张，何，王，威辛利布。
进行实验:张，月亮。
执行数据分析：张，萨朗迪，卡拉里。
对手稿的写作有贡献的:张，何，魏谢堡。
补充说明:表1在在线出现的快进版本中意外列为图5，在线出现在线3月3,2011。表1现已正确列出。
脚注
- 已收到2020年9月29日。
- 公认2021年2月17日。
本研究由国家卫生学院（NIH）国家一般医学科学研究所（NIGMS）资助[GRANT U19-GM61388]（药物遗传学研究网络），NIGMS [GRANT R01-GM28157];NIH国家酒精滥用和酗酒研究所（NIAAA）[GRANT R01-AA27486]和[GRANT KO-A-AA2850]，NIGMS [GRANT R01-GM125633]，以及个个性化医学中心。
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本文有补充材料可用www.1zgc.com.．
缩写
- BFP.
- 蓝色荧光蛋白
- CPM
- 每分钟计数
- DMS.
- 深静态扫描
- FACS.
- 荧光激活的细胞分选
- HBSS.
- 汉克斯的平衡盐溶液
- 加
- 轻微的等位基因频率
- ngs.
- 新一代测序
- OATP1B1
- 有机阴离子转运蛋白1B1
- 羊痘疮
- 开放阅读框
- TM4.
- 跨膜结构域4.
- vus.
- 意义不明的变种
- WT
- 野生型
- 版权所有©2021由作者（s）
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