摘要
KZR-616是一种不可逆的人免疫蛋白酶体三肽环氧酮选择性抑制剂。KZR-616在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮动物模型中具有良好的治疗活性，抑制免疫蛋白酶体可在体外产生抗炎活性，目前正在开发用于多种自身免疫和炎症疾病的潜在治疗。酮环氧化合物药效团的存在在先导物优化和临床候选药物分析期间的药物代谢研究中提出了独特的挑战。雷竞技客服本研究提出了一个彻底和系统的体外和基于细胞的酶代谢和动力学研究，以确定主要酶参与代谢和消除KZR-616。在没有NADPH的肝微粒体中，KZR-616及其类似物被转化为稳定性不同程度的无活性二醇衍生物。二醇的形成也被证明是猴子药代动力学研究的主要代谢物，并与单个化合物的体外稳定性结果相关。对完整肝细胞的进一步研究表明，KZR-616代谢对微粒体环氧化物水解酶(mEH)抑制剂敏感，而对细胞色素P450 (P450)或可溶性环氧化物水解酶(sEH)抑制剂不敏感。在体外研究中，原代人肝细胞被确定为最强大的mEH活性来源。这些发现也表明KZR-616在体内的暴露不太可能受到P450和sEH抑制剂或诱导剂的共同给药的影响。
意义的声明本研究对KZR-616及其类似物在体外和细胞酶系统中的代谢和动力学进行了全面系统的研究。获得的信息有助于在先导化合物优化过程中评估新型共价蛋白酶体抑制剂。这些研究还证明了与KZR-616和另外两种三肽环氧酮的体内药代动力学相关的可靠来源体外测试系统。
介绍
通过对三种用于治疗B细胞肿瘤（如多发性骨髓瘤和套细胞淋巴瘤）的化合物的监管批准，蛋白酶体已被确认为治疗药物靶点(布罗斯等人，2004年;Kisselev等人，2001年;Kisselev等人，2012年;Herndon等人，2013年;Offidani等人，2014年;Gentile et al.， 2015)。这些化合物包括两类化学成分:可逆硼酸衍生物硼替佐米(VELCADE)和ixazomib (NINLARO)以及基于四肽环氧酮的化合物carfilzomib (Kyprolis)。与硼替佐米和ixazomib不同，卡非佐米是新一代不可逆抑制剂中的第一个，以蛋白酶体亚基为靶点，具有长时间抑制和高选择性(Demo等人，2007年;库恩等人，2007年;周等，2009;Arastu-Kapur等人，2011年;Harshbarger等人，2015年)新一代蛋白酶体抑制剂是目前正在研究的治疗其他疾病的一类重要药物(Teicher和Tomaszewski, 2015年)。
免疫蛋白酶体是蛋白酶体的一种独特形式，主要表达于免疫效应细胞(米勒等人，2013年)。免疫蛋白酶体与普遍表达的组成性蛋白酶体的区别在于其存在三个不同的催化亚基:低分子质量多肽(LMP) 7、LMP2和多催化内肽酶复合物1。暴露于炎性细胞因子(如肿瘤坏死因子)时，非免疫细胞也可诱导这些活性位点亚基α(肿瘤坏死因子-α)或干扰素γ(Ferrington和Gregerson, 2012年)。免疫蛋白酶体的选择性抑制导致来自免疫效应细胞的炎症细胞因子的减少，并能在几种自身免疫性疾病的动物模型中阻止疾病进展，包括类风湿关节炎、多发性硬化症和系统性红斑狼疮(SLE) (Puttaparthi和Elliott, 2005年;埃杰勒等人，2006年;Groettrup等人，2010年;Basler和Groettrup, 2012年;米勒等人，2013年;Basler等人，2015年)。kzr - 616 (图1)是一种三肽环氧酮，选择性和不可逆地抑制人免疫蛋白酶体的LMP7和LMP2亚单位；经过一场彻底的药物化学运动后，它被选为临床开发药物(约翰逊等人，2018年)。在人外周血单个核细胞中，KZR-616阻断炎症细胞因子的产生，包括TNF-α、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素-6和白细胞介素-23。在淋巴细胞中，t细胞产生干扰素γ肿瘤坏死因子-α， KZR-616抑制粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子及活化b细胞向原浆细胞分化(Muchamuel et al.， 2017)最后，在类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮的小鼠模型中，KZR-616以良好耐受剂量阻断疾病进展，而不影响正常的T细胞依赖性免疫反应(Muchamuel et al.， 2017;约翰逊等人，2018年)KZR-616目前正在SLE和狼疮性肾炎患者的2期临床试验中进行评估。
KZR-616, KZR-59177, KZR-59240及其二醇衍生物卡非佐米和奥普罗佐米的化学结构。
与carfilzomib一样，KZR-616是一种精细的化学选择性、不可逆的n端苏氨酸蛋白酶共价抑制剂，这类蛋白酶的蛋白酶体活性位点亚基几乎是排他的(Kisselev等人，2012年)。尽管以硼酸为基础的蛋白酶体抑制剂有一个主要的代谢途径，包括通过经典的1期细胞色素P450 (P450)酶的氧化，carfilzomib被认为是通过肽酶切割和环氧酶水解为非活性的二醇(杨等人，2011年;王等人，2013年)。Oprozomib，一种在多发性骨髓瘤的临床调查中的胭脂红蛋白的三肽环氧酮类似物，显示为微粒环氧化物水解酶（MEH）的基材（王等人，2017年)鉴于KZR-616与卡非佐米和奥普唑米在结构上的相似性，我们旨在确定在慢性疾病临床试验开始之前KZR-616代谢中涉及的主要和特定代谢途径和酶。此外，通过实施全面、系统的体外实验方法和评估大型动物的药代动力学，我们能够进行体外到体内的外推相关性，以确定哪些替代物吸收、分布、代谢和排泄（ADME）体外模型系统对于新型环氧酮类临床候选药物的开发是最有用的。
材料和方法
材料和细胞生长条件。
所有化学品和试剂均从Sigma（密苏里州圣路易斯）获得，液相色谱[质谱（MS）级]溶剂从Fisher Scientific（宾夕法尼亚州匹兹堡）获得。KZR-616，氘化KZR-616（d8.-KZR-616）、KZR-59587、KZR-59177、KZR-59240和KZR-616类似物在Kezar生命科学公司合成。2- 2-磺酰基丙酰胺（NSPA）、人重组MEH和可溶性环氧化物水解酶（SEH）是戴维斯加利福尼亚大学Bruce Hammock实验室的礼物。纽曼等人，2003年;Morisseau等，2008;Montellano 2018).1-三氟甲氧基苯基-3-（1-丙酰哌啶-4-基）脲（TPPU）和1-氨基苯并三唑（1-ABT）从Sigma.获得。肝脏亚细胞组分包括雄性或雌性猴肝微粒体（6个组分；20 mg/ml）、胞浆（6个组分；10 mg/ml）、人类肝脏亚细胞组分包括雄性或雌性肝微粒体从Sekisui Xenotech（堪萨斯州堪萨斯市）购买了（10,20 mg/ml的细胞库）、细胞质（混合性别；50,10 mg/ml的细胞库）、人类冷冻保存肝细胞（100个供体，混合性别）和培养基（K8400）以及猴子冷冻保存肝细胞（5个雄性食蟹猴供体，PPCH 2000）和培养基（20-1-0526）.人肝细胞在37℃下，在95%空气/5%一氧化碳的环境中培养2.．
NADPH存在和不存在时肝微粒体的代谢稳定性。
评估了人(H)和猴(M)肝微粒体(LMs)加或不加NADPH的反应。将测试化合物和探针底物与含或不含1.2 mM NADPH的HLM (0.5 mg/ml)和MLM (0.25 mg/ml)混合在0.1 M含3.3 mM MgCl的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中2.. 将混合物保持在37°C下长达60分钟，并通过添加两体积含有0.1%甲酸（FA）和25 nM内标物（IS）d的乙腈在指定时间点终止反应8.kzr - 616。采用以下所述的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)或液相色谱-紫外检测(LC-UV)方法对测试化合物及其二醇代谢物和探针底物的消失情况进行监测。每个实验反应进行三次。固有间隙(Clint)由母体化合物消失率显示。睾酮（50µM）和顺式对称二苯代乙烯氧化物(所以;50 μ M)分别作为P450和mEH的探针底物。
猴肝细胞的代谢稳定性。
冷冻保存的猴肝细胞在培养基中解冻并重悬。KZR-59177, KZR-616和KZR-59240(1µM)顺式-某某反式-SO)与猴肝细胞(0.25 × 106.在37°C的细胞培养箱中，加入95%的空气和5%的CO2.40分钟。通过添加两个体积的含有0.1%FA和25 nM IS d的乙腈，在不同时间点终止反应8.-KZR-616。离心样品，KZR-616、KZR-59177和KZR-59240；其二醇代谢物KZR-59587、KZR-59165和KZR-59433；通过LC-MS/MS和LC-UV对探针底物的代谢物进行定量，如下所述。睾酮（50µM），顺式-SO（50µM），以及反式-将SO（50µM）分别用作P450和环氧化物水解酶（EH）的探针底物。
P450在LM中的表型。
KZR-616在六种主要P450亚型的已知化学抑制剂存在和不存在的情况下在HLMs中培养：呋喃茶碱（CYP1A2，10µM）、孟鲁司特（CYP2C8，5µM）、磺胺苯唑（CYP2C9，5µM）、苄基涅盘醇（CYP2C19，1µM）、奎尼丁（CYP2D6，1µM）和酮康唑（CYP3A4/5，1µM）.反应混合物在含有3.3 mMgCl的100 mM磷酸钾（pH 7.4）缓冲液中含有最终浓度为1µM KZR-616、0.2 mg/ml HLM蛋白质和1 mM NADPH2.．代谢程度计算为KZR-616在孵育15和30分钟后与0分钟对照反应孵育相比的消失。并对KZR-59587 (KZR-616二醇)的形成进行了监测。
肝微粒体结合。
MLMs (0.25 mg/ml)和HLMs (0.5 mg/ml)与50µM的NSPA在0.1 M磷酸钾缓冲液(pH 7.4)中预孵育10分钟，然后加入KZR-616、KZR-59177、KZR-59240和氯丙嗪(对照)，最终浓度为1µM, 37℃孵育30分钟。37℃，85,000 rpm离心4小时，加入等量无化合物空白上清液(30µl)，加入等量无化合物空白上清液(30µl)。样品用含0.1% FA的150µl内标液乙腈/甲醇(1:1)淬火。所有样品离心后上清液进行LC-MS/MS分析。试验物与蛋白结合百分率计算公式为:% Free =(试验物上清液浓度/ LM残体中试验物浓度)× 100%;%绑定测试化合物= 100%−% Free
血浆蛋白结合。
KZR-616通过平衡透析与食蟹猴血浆结合。在缓冲腔中加入350µl磷酸缓冲液(pH7.4)、200µl 5µM KZR-616和对照组(phenacetine;奎尼丁和华法林)到红方。封板并在37°C、100 rpm的轨道激振器中孵育5小时。将50µl血浆(来自红侧)与50µl空白缓冲液混合，50µl缓冲液(来自缓冲室)与50µl空白血浆混合，制备重复分析样品。样品用含0.1% FA的150µl内标液乙腈/甲醇(1:1)淬火。所有样品离心后上清液进行LC-MS/MS分析。
猴子体内的药代动力学。
所有动物研究均按照美国国立卫生研究院通过和颁布的《实验动物护理和使用指南》进行，并获得该机构动物护理和使用委员会或当地同等机构的批准(实验动物资源研究所，1996)KZR-616、KZR-59177和KZR-59240作为单次皮下给药给食蟹猴。总共有16只雄性、非天真和非禁食动物被随机分为三组（四只动物/组），在10%聚山梨酯（PS-80）水溶液中接受剂量为3 mg/kg的试验化合物.在给药前、给药后2、5、10、20和30分钟以及给药后1、2、4、8和24小时采集血样。通过在4°C下以3000 rpm离心5分钟获得血浆样品。通过添加三体积的乙腈（含0.1%FA和25 nM IS d）使血浆样品淬火8.kzr - 616。通过LC-MS/MS对亲本和二醇代谢物水平进行定量，如下所述。
通过重组人EH代谢。
在0.1 M Tris-HCl缓冲液中对含0.1 mg/ml无脂肪酸牛血清白蛋白(BSA)的mEH (pH 9.0)和sEH (pH 7.5)进行反应。将一系列酶培养液在37℃下预热5分钟，然后加入1µM carfilzomib或KZR-616。mEH的酶浓度分别为2、4、8、10µg/ml, sEH的酶浓度分别为1、10、25、50、100µg/ml。加入含0.1% FA和25 nM IS d的乙腈溶液60分钟后终止反应8.-KZR-616。通过LC-MS/MS对二醇的形成进行定量。反式-SO(50µM顺式-SO(50µM)分别作为sEH和mEH的探针底物，LC-UV对二醇形成进行定量，如下所示。
KZR-616在人肝细胞中的代谢谱。
将汇集的冷冻保存的人肝细胞解冻并重新悬浮在细胞培养基中。含有肝细胞的反应（2×106.细胞/ml)和KZR-616(10µM)在细胞培养液中进行，24孔细胞培养板，37℃细胞培养箱，95%空气和5% CO2.2小时。通过添加四体积的含有0.1%FA的乙腈终止反应。一份单独的肝细胞等份（2×106.用四个体积的乙腈淬火细胞，然后加入KZR-616（10µM）作为对照样品。所得混合物在4000 rpm下离心15分钟。上清液在N2.在LC-MS/MS分析之前，使用30%乙腈（v/v）重组所得残留物。使用岛津LC-20应用生物系统质谱仪（API 4000 QTrap）进行代谢物鉴定。使用Kinetex 2.6进行色谱分离µC18 100A色谱柱(3.0 mm × 50 mm)，流动相(A:含0.1% FA的水;乙:乙腈含0.1% FA)，流速0.6 ml/min。流动相步长从5%(0.3分钟)增加到95% B(12分钟)。总运行时间为15分钟。
人类肝细胞的代谢。
合并冷冻保存人肝细胞（0.5×106.细胞/ml)在含0.1% DMSO、不同浓度EHs抑制剂或P450(10µM NSPA 5分钟;200µM TPPU和500µM 1-ABT孵育30分钟)，置于37°C、95%空气和5% CO的细胞培养箱中2..预培养后，KZR-616（1µM）和参考底物（50µM），顺式-那么反式-SO）在37°C细胞培养箱中，在有或无（分别为1-ABT、NSPA和TPPU）的情况下培养三次1小时。如图所示，在1、10、20、30、40和60分钟后，通过添加两体积含有0.1%FA和25 nM IS d的乙腈终止反应8.kzr - 616。将样品离心，采用LC-MS/MS和LC-UV对KZR-616、二醇和参考底物的代谢物进行定量，如下所示。
人血浆中KZR-616的代谢物谱。
收集每周皮下注射KZR-616，持续13周的SLE患者的血浆样本(nct03393013)。对接受KZR-616最大给药剂量75 mg的患者样本进行分析。从4名受试者中的1名(110-004、112-021、113-002和116-012)第29天采血的时间点(给药前、0.0833、0.25、0.5、1、2、4、8小时)收集每个样本的AUC。每个血浆样品(400µl)用3体积含0.1% FA的ACN/MeOH(1:1)提取，3000 rpm离心15分钟。每个样品的上清液在氮气流下浓缩，重组到200µl含有0.1% FA的30% ACN/MeOH(1:1)中。样品经液相色谱-质谱系统分离鉴定。采用Waters XBridge C18色谱法，3.0 × 150 mm, 3.5µm，流动相(a:水含0.1% FA;乙:乙腈含0.1% FA)，流速0.8 ml/min。流动相阶跃由0.3 min时的3%增加到25 min时的35% B和26 min时的90% B。总运行时间为35分钟。 Metabolite identification was conducted using an AB Sciex Triple TOF API6600 mass spectrometer equipped with a Shimadzu Nexera UPLC system. Metabolite structures were assigned based on accurate mass (±5 mDa) determination of a parent ion from a full-scan TOF MS followed by triggered MS/MS fingerprints.
反应动力学。
KZR-616的反应动力学在雌性和雄性HLMs（0.5 mg/ml）和MLMs（0.2 mg/ml）中于0.1 M磷酸钾缓冲液（pH 7.4）中进行使用0.1 mg/ml BSA在37°C下放置30分钟。还研究了KZR-616在37°C下的肝细胞维持培养基中放置30分钟的动力学。KZR-616在4µg/ml重组人mEH中37°C下放置30分钟，在0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中测定反应动力学含有0.1 mg/ml BSA。预热酶5分钟后，添加KZR-616（0–1000µM）以启动反应。为了研究卡非佐米的动力学，优化并使用2µg/ml预热的重组人mEH在37°C下在含有0.1 mg/ml BSA的0.1 M Tris-HCl缓冲液（pH 9.0）中培养20分钟。
NSPA分别在女性和男性HLMs (0.5 mg/ml)、MLMs (0.25 mg/ml)、人肝细胞(0.5 × 10)中进行检测6.细胞/ml)和重组人mEH(4µg/ml)检测IC50使用不同浓度的NSPA(0-100µM)在酶的反应缓冲液中，在37°C下处理15-30分钟。在重组人mEH中检测NSPA，以确定IC50关于carfilzomib环氧化物水解。简单地说，将预热的重组人mEH（2µg/ml）与1µM CFZ在37°C的NSPA浓度范围内（0–10µM）孵育20分钟。通过添加两体积含有0.1%FA和25 nM IS d的乙腈终止反应8.-KZR-616以及KZR-616和卡非佐米的二醇衍生物的浓度使用LC-MS/MS方法进行定量。使用非线性回归数据分析（GraphPad Prism 7.04），将每组数据拟合到一个简单的米氏动力学模型。每个实验反应分两次进行。顺式-因此（50µM）培养作为阳性对照平行进行。
环氧化物水解酶抑制活性。
研究KZR-616在LM和重组EH中对mEH和sEH的体外抑制作用。顺式-某某反式-SO分别作为mEH和sEH的探针基底。为了测试KZR-616作为mEH抑制剂，将预热的混合HLMs (0.5 mg/ml)、MLMs (0.25 mg/ml)和重组mEH(4µg/ml)孵育顺式-SO(50µM)，在37℃反应缓冲液中不存在或存在100µM KZR-616时，静置30分钟。为了研究KZR-616作为sEH的抑制剂，将预加热的人肝细胞溶胶(0.5 mg/ml)和重组sEH(100µg/ml)孵育反式-SO(50µM)和100µM KZR-616分别加入0.1 M含0.1 mg/ml BSA的磷酸钾缓冲液(pH 7.4)和0.1 M含0.1 mg/ml BSA的Tris-HCL缓冲液(pH 7.4)。反应用两体积的冷乙腈和浓度的二醇衍生物顺式-某某反式-使用LC-UV方法对SO进行定量，如下所述。
LC-MS/MS和LC-UV定量。
LC-MS/MS方法用于使用配备有电喷雾电离源的AB Sciex 5500 Q-Trap质谱仪对卡非佐米、KZR-616、KZR-59177、KZR-59240、P450探针底物（睾酮）及其二醇衍生物进行定量。对每种化合物m/z（母体>产物离子）的以下质量转变进行多反应监测：587.4>371.2、605.1>389.2、571.3>389.6、589.7>150.1、607.3>391.2、719.8>402.2、737.9>402.2、289.3>109.1、305.1>269.1，以及KZR-616、KZR-59587（二醇）、KZR-59177、KZR-59165（二醇）、KZR-59240、，KZR-59433（二醇）卡非佐米，睾酮，6β-testosterone，是d8.分别kzr - 616。采用YMC-pack pro C18 (3µ(A)水和(B)乙腈含0.1% FA，流速为0.5和1.0 ml/min。流速为0.5 ml/min时，流动相在5% B条件下开始0.5分钟，在2.3分钟内线性进展到95%乙腈，在95% B条件下保持0.7分钟，在0.1分钟后返回到5% B条件下。流速为1.0 ml/min时，流动相从10% B开始，持续0.5分钟，随后在1.7分钟内线性变化至95%乙腈，在95% B保持0.5分钟，在0.1分钟返回到5% B。
量化的顺式所以,反式-因此，使用LC-30AD系统和SPD-20AV检测器实现了相应的代谢物。使用Kinetex反相C18（1.7）实现色谱分离µ柱，2.1 mm × 50 mm，流动相为(A)水和(B)乙腈，含0.1% FA，流速为0.5 ml/min。流动相开始在10% B溶液中停留1.0分钟，5分钟后逐渐增加到95%乙腈溶液，在95% B溶液中停留1.0分钟，0.1分钟后返回到10% B溶液。
通过绘制每个测试化合物与IS (d8-KZR-616)的峰面积比与每个化合物的相应浓度在校准范围内(1-5000 ng/ml)，并拟合线性回归方程，建立了每个测试化合物的校准曲线。然后用校准曲线计算每个测试化合物的浓度。
动力学分析和IC50数据处理。
KZR-616的环氧化物水解动力学是从KZR-616在0至1000µM.K.浓度范围内的重复实验中获得的M及V马克斯采用GraphPad Prism软件将二醇(KZR-59587)地层数据拟合到Michaelis-Menten方程中。集成电路50通过使用log（抑制剂）与响应变量斜率的非线性拟合来计算。IC.50数据只有在抑制剂浓度范围内才能被验证。
采用GraphPad棱镜进行统计分析。所有数据均以平均值±标准差格式表示。对于动力学和IC5095% CI(置信区间)阈值与拟合优度(R2.> 0.99)。
结果
KZR-616及其类似物在肝微粒体和猴肝细胞中代谢的表征。
KZR-616是从一项涉及400多个三肽环氧酮合成的药物化学研究中选择的(专利：McMinn D等。专利申请US9657057B2;专利申请US10647744B2)。为了进一步了解这种化学类型的结构-活性关系，我们利用HLM和MLM在体外模型系统中评估了79种有效和选择性类似物的代谢稳定性，它们都表现出高水平的mEH和P450活性。睾丸激素,顺式-那么反式-SO作为P450 (补充图1)、mEH和sEH(补充图2),分别。在没有NADPH的情况下，对化合物和LM混合物中环氧化物水解酶的稳定性进行了评估，以防止P450的活性。如图所示图2A，广泛的环氧化合物水解稳定性跨越79个测试化合物被注意到在HLM和传销培养。选择KZR-616、KZR-59177(不稳定类似物)和KZR-59240(稳定类似物)作为工具化合物，探索p450介导的LM代谢途径。在LM培养体系中，随着NADPH的添加，KZR-616、KZR-59177和KZR-59240的内在清除率显著增加，表明P450酶在该实验体系的代谢中起主导作用(表1)。
（a）在没有NADPH的情况下，人和猴肝微粒体的KZR-616和类似物的代谢。检测到的残留KZR-616，KZR-59177和KZR-59240的百分比和在没有NADPH的情况下在HLMS（0.5mg / mL）或MLMS（0.25mg / ml）中的总共79种类似物。KZR-616和类似物的初始浓度为1μm。使用LC-MS / MS测定量定量KZR-616和类似物的残留浓度。数据显示为平均值±S.D.从三份孵化。（b）KZR-616的代谢和猴肝细胞的类似物。KZR-616，KZR-59177和KZR-59240的百分比及其在猴肝细胞的最初父母中剩余及其二醇形成（0.25×106.细胞/ml)孵育40分钟。亲本的初始浓度为1µM。用LC-MS/MS分析测定亲本及其二醇的浓度。数据以重复孵育的平均值±标准差表示。
在NADPH存在或不存在时，KZR-616及其类似物在HLMs和MLMs中的体外代谢稳定性
预测t1／2和Clint从体外试验中获得。数据以平均值±表示
S.D. (n = 3). conc。样品中化合物的含量为1µM。采用超离心法对试验化合物进行LM结合(%)。
接下来，我们确定了微粒体结合对三种测试化合物的内在清除率的影响。KZR-616的百分比将平均值为7.4％和12.3％，分别为猴和人LM混合物的KZR-59240的21.3％和20.4％。由于LM混合物中的稳定性问题导致负％的界限值，KZR-59177的百分比率不适用。总的来说，KZR-616和KZR-59240之间的百分比偏合值在各自的人和猴LM中小，并且因此，KZR-616和KZR-59240的固有间隙（表1)可以被认为是可靠的。
为了评估这三种化合物的代谢稳定性，我们还使用猴肝细胞选择细胞基体外模型，其表现出高水平的MEH和P450活性。如图所示图2B，使用合成标准对KZR-59177、KZR-616和KZR-59240的消失及其二醇形成进行定量。培养40分钟后，KZR-59177、KZR-616和KZR-59240的母体和二醇的回收率分别为82.0%、96.4%和100%。这些定量结果表明，环氧化物水解是最有效的方法猴肝细胞中三种工具化合物的主要代谢途径。
P450表型显示，CYP3A4/5是参与KZR-616微粒体代谢的主要酶，CYP2C8在其代谢中起次要作用。KZR-616二醇(KZR-59587)的形成不受P450抑制剂的影响，表明其他酶，如环氧水解酶，在二醇的形成中发挥重要作用(补充表1)。
KZR-616、KZR-59177和KZR-59240在猴子体内的药代动力学
考虑到KZR-616、KZR-59177和KZR-59240在体外代谢稳定性存在明显差异，我们进一步研究了KZR-616、KZR-59177和KZR-59240单次皮下给药后在食蟹猴体内的药代动力学(PK)。如图所示表2.，总曝光量(曲线下从零到无穷大的面积，AUC正)KZR-59240最高，其次是KZR-616和KZR-59177。确定二醇衍生物是每种化合物的主要代谢物，AUC比率（二醇：母体）KZR-616、KZR-59177和KZR-59240的PK分别为3.40±0.81、3.35±1.20和0.78±0.46。在没有NADPH的情况下，每种化合物的母体和二醇的PK与MLM的稳定性结果一致，其中P450酶未被激活。有趣的是，给予KZR-59240，其对二醇形式具有抗性体外培养，导致猴子体内显著水平的二醇形成（二醇/母体的AUC比率：0.78±0.46）。
人mEH和sEH参与KZR-616环氧化物水解。
KZR-616在结构上与carfilzomib相关，后者在体内也代谢为非活性二醇(表2.)。由于鉴定环氧化物水解是体内KZR-616的主要代谢途径，我们评估了使用重组酶从KZR-616和Carfilzomib对二醇形成的MeH和SEH的贡献。形成KZR-616的二醇衍生物（图3A)和卡非佐米(图3B)随着mEH从2 μ g/ml增加到10 μ g/ml而增加，但在重组sEH达到200 μ g/ml时，两种化合物均未检测到显著的二醇衍生物。研究了KZR-616在人、猴肝微粒体(含mEH)和肝细胞质(含sEH)中的环氧水解。探针底物顺式-SO(50µM反式-SO（50μm）分别用作MEH和SEH活动的对照（补充图2)与使用重组酶的研究结果类似，随着肝微粒体浓度的增加，二醇的形成增加，但在与肝细胞溶质孵育时，二醇的形成最少(图3、C和D)。综上所述，这些数据表明，KZR-616和carfilzomib的环氧化水解主要是由mEH介导的，而sEH在这些化合物的代谢中几乎不起作用。
重组mEH和sEH中KZR-616和carfilzomib的环氧化物水解；KZR-616在HLMs、MLMs以及人和猴细胞溶胶中的环氧化物水解。（A） KZR-616在重组人mEH（2-10µg/ml）和sEH（20-100µg/ml）中的环氧化物水解。（B） 重组人mEH（2-10µg/ml）和sEH（20-200µg/ml）中卡非佐米（CFZ）的环氧化物水解。（C） KZR-616在HLM（0.25–1 mg/ml）和人细胞溶胶（0.4–1 mg/ml）中的环氧化物水解。（D） KZR-616在MLM（0.2–1 mg/ml）和猴细胞溶胶（0.1–1 mg/ml）中的环氧化物水解。使用LC-MS/MS分析法对KZR-616、卡非佐米及其二醇的浓度进行定量。数据以三次培养的平均值±标准偏差表示。
KZR-616在人肝细胞和血浆中的代谢。
接下来，我们定量评估了KZR-616在人肝细胞中的消失和KZR-59587及其他代谢物的形成。KZR-616暴露2小时后的代谢物如图4-3A所示。在该体系中，KZR-616的主要途径是环氧直接水解。只有微量的额外代谢物，包括去甲基化和氧化，以及氧化和环氧水解的结合被检测到。各代谢物的MS/MS谱分别显示在图4 - 1．
鉴定代谢物的MS/MS光谱。在人肝细胞中培养2小时后鉴定的代谢物（2.0×106.细胞/ ml）。（4-2）KZR-616人类肝细胞的代谢和1-ABT，NSPA和TPPU的作用。（a）在存在或不存在1-abt的存在或不存在下留在人肝细胞中的KZR-616的百分比。（b）在存在或不存在1-ABT的存在或不存在下在人肝细胞中形成二醇KZR-59587。（c）在存在或不存在NSPA和TPPU的存在或不存在下留在人肝细胞中的KZR-616的百分比。（d）在存在或不存在NSPA和TPPU的存在或不存在下在人肝细胞中形成二醇KZR-59587。孵育中冷冻保存的人肝细胞的浓度为0.5×106.细胞/ ml。KZR-616的初始浓度为1μm。抑制剂的浓度分别为1-ABT，NSPA和TPPU为0.5mm，10μm和200μm。使用LC-MS / MS分析量化KZR-616和KZR-59587的浓度。数据以重复孵育的平均值±标准差表示。（4-3）KZR-616在人肝细胞和血浆中的代谢途径。（4-3A）在合并冷冻保存人肝细胞中暴露KZR-616（10μm）后的代谢物鉴定（2×106.细胞/ ml）2小时。（4-3B）来自四名患者（0-8小时的人血浆中的代谢物鉴定，接受75mg剂量的KZR-616。
我们使用1-ABT (pan-P450抑制剂)、NSPA (mEH抑制剂)和TPPU (sEH抑制剂)来评估这些代谢途径。KZR-616对P450抑制的清除率没有差异(图4-2)，其固有清除率分别为16.5±0.306和18.6±0.400µl/min/106.细胞中分别存在和不存在1-ABT。在60分钟的疗程中，KZR-616和二醇的回收率约为100%。TPPU浓度达到200µM时，KZR-616的消除和二醇的形成均不受影响。相反，NSPA影响亲本的丢失和二醇的形成，表明mEH在KZR-616在人肝细胞的代谢中起主要作用。
4名患者(服药后0-8小时)接受75 mg剂量的KZR-616，其血浆中鉴定的代谢物如图4-3B所示。KZR-59587(二醇)为主要代谢物。定量分析KZR-59587及其亲本KZR-616的峰面积占KZR-616总峰面积的百分比，所有观察到的代谢物分别为33.8和61.2;45.8和49.0;47.9和46.5;4例患者分别为43.8和51.8 (表4.).其他代谢物，包括KZR-59587的异构体、氧化、水解和脱氢以及KZR-616的双重氧化，均小于KZR-616及其代谢物总峰面积的1%。
KZR-616环氧化物水解动力学研究。
接下来，我们确定了在KZR-616浓度范围内(0-1000µM)使用人重组mEH、HLMs和人肝细胞生成二醇的反应动力学(图5,5B)。应用优化的酶浓度和培养时间，以确保初始meh介导的水解产物在线性形成范围内，以便准确估计(图6).抑制KZR-616的环氧化物水解和顺式NSPA对so进行了并行评估。NSPA抑制meh介导的KZR-616水解，平均IC50在不同的测试系统中，μ M的含量从0.409到0.826不等(图7)通过这些实验，我们能够获得动力学常数（KM)，最大速度（V马克斯)和效率(V马克斯/ KM)KZR-616环氧化物水解的研究(表3)。与预期一样，重组mEH的代谢效率最高。雌性/雄性人类和猴子肝脏微粒体的代谢效率分别为重组mEH的0.33%-0.45%和4.5%-4.6%，表明HLMs中mEH水平低于mlm。
KZR-616在HLMs、MLMs、重组人MEH和人肝细胞中的环氧化物水解动力学。（A）雄性和雌性HLMs、MLMs和重组人MEH中二醇KZR-59587的形成动力学在37°C下进行30分钟。（B）在37°C下进行30分钟的人肝细胞中KZR-59587的形成动力学M及V马克斯通过将曲线拟合到Michaelis-Menten方程来估计值。数据表示重复培养的平均值±标准偏差。
NSPA抑制KZR-616在HLMs、MLMs、人肝细胞和重组人mEHs中的环氧水解。(A) NSPA对男性和女性HLMs中mEH活性的抑制。(B) NSPA对男女传销中mEH活性的抑制作用。(C) NSPA对人肝细胞mEH活性的抑制。(D) NSPA对重组人mEH活性的抑制。IC.50使用非线性回归数据分析估计值。数据以重复孵育的平均值±标准差表示。
探针底物的环氧化物水解抑制顺式-某某反式-所以KZR-616。（A） 方案顺式-SO代谢和抑制顺式-SO水解KZR-616。(B)方案反式-SO代谢和抑制反式-SO水解KZR-616。的二醇衍生物顺式-某某反式-所以(R,R-对苯二甲酸偶姻和中邻苯偶姻)。
最后，我们试图确定KZR-616是否可以抑制重组酶，LMS或完整细胞中的EH活性。环氧化物水解顺式-SO经mEH和环氧化物水解反式当KZR-616的浓度达到100µM时，sEH对-SO的影响不受影响(图)。
讨论
靶向共价抑制剂与传统可逆抑制剂相比有几个优点，包括提高疗效和选择性(Leung等人，2017年).基于肽环氧酮的蛋白酶体抑制剂，如卡非佐米和奥普唑米，尽管体内清除迅速，全身暴露时间短，但部分由于蛋白酶体活性位点的共价修饰，可诱导长期药效学效应(杨等人，2011年;王等人，2013年)。这些化合物主要通过环氧化物水解代谢为非活性二醇，这使分子变得非活性。鉴于这一非传统的代谢途径，目前还没有明确的体外测试系统来研究这类化合物的代谢特性。KZR-616是一种新型肽类环氧酮，被设计用于选择性结合免疫蛋白酶体活性位点LMP7和LMP2，目前正在自身免疫性疾病的2期临床试验中进行评估(约翰逊等人，2018年)。我们研究了在多种体外测试系统中的KZR-616及其类似物，该系统从重组酶传统到活细胞孵育，并将这些数据与施用非人的灵长类动物在给予非人类灵长类动物后，以确定未来药用化学运动的最佳体外测试系统。
在这项工作中，我们试图发展ADME分析，可用于筛选不可逆共价蛋白酶抑制剂。在药物发现阶段，我们遇到的一个挑战是找到一个最佳的体外试验系统，可以关联体内药代动力学结果。研究了三种工具化合物(KZR-616、KZR-59177和KZR-59240)在人类和猴子肝脏微粒体(LMs)中NADPH存在和不存在时的代谢稳定性。我们发现Clint这些化合物在NADPH存在时由P450 + EH驱动，而在NADPH不存在时仅由EH驱动。在LM中，CYP3A4/5是P450驱动代谢的主要亚型。但PK数据显示其二醇衍生物为主要代谢物，说明mEH在体内起主要作用，p450介导的代谢不参与。这意味着体外LM测试系统不会产生相关或指示性的代谢结果。
通过使用猴肝细胞，我们发现二醇衍生物是这些化合物的主要代谢物，表明mEH在肝细胞系统中起主要作用，并与PK结果相关。在人类肝细胞中进一步研究了临床候选KZR-616。KZR-616在人肝细胞中的代谢谱表明，mEH代谢途径产生的二醇KZR-59587是KZR-616的主要代谢物，只有氧化和脱氢途径产生的微量代谢物。使用P450和EHs抑制剂研究人类肝细胞中KZR-616的代谢也得出结论，mEH介导的代谢是主要途径。与猴子系统类似，接受KZR-616治疗的患者的人体血浆样本代谢谱显示二醇KZR-59587是主要代谢物。所有其他代谢物均少于母体和观察代谢物总量的1%。因此，体外和体内的猴子系统都可以预测KZR-616在人体内的ADME特性。
肝微粒体是一种广泛用于先导化合物发现项目中高通量ADME筛选的体外测试系统。然而，最近有报道与体内研究结果的相关性和P450活性的高估有关(Tingle和Helsby，2006年;布朗等人，2007年)。在LM制剂中，NADPH是P450活性的必要辅助因子，KZR-616及其类似物被迅速清除，但母质和二醇的回收率较低(在1小时内约为50%)，表明有其他代谢途径参与其中。然而，在没有NADPH的情况下，79种相关化合物均有不同程度的稳定性。二醇产物也是给猴子服用KZR-616和其他两种结构相关化合物后发现的主要代谢物。在体内测量的这些化合物的PK暴露与在没有NADPH的LM培养中观察到的稳定性密切相关。有趣的是，对于KZR-59240，在LM培养中是稳定的，并且显示了最小的二醇形成，在体内测量了二醇代谢物(KZR-59433)的显著形成。在没有NADPH的标准LM培养物的代谢物检测与体内药代动力学研究之间的差异表明，在LM测试系统中，EH酶活性可能在微粒体制备过程中丧失或被其他酶抑制。
为了克服使用LM研究肽环氧酮代谢的主要缺陷，我们使用冷冻保存的人肝细胞作为体外试验系统。完整的肝细胞包含I期和II期代谢酶，可能提供一个更全面的系统，将体外试验结果与体内PK相关联(McGinnity等人，2004年;王志强等，2005;布朗等人，2007年)。与PK研究中观察到的相似，与完整的肝细胞孵育后，KZR-616的主要代谢物是二醇。正如使用酶特异性探针底物所证明的，肝细胞同时含有sEH和mEH，我们使用了异构体特异性抑制剂来表型KZR-616代谢。mEH抑制剂NSPA阻止了二醇的形成，但无论是TPPU(一种sEH抑制剂)还是ABT-1(一种pan-P450抑制剂)都对二醇的形成或失去母体化合物没有影响。因此，利用人肝细胞，我们能够匹配在体内看到的代谢物谱，并确定KZR-616形成二醇的特定酶。
环氧水解酶是在哺乳动物中普遍表达的酶家族(德瓦济等人，1990;Enayetallah等人，2006年;Morisseau 2013;Gautheron和Jéru, 2020)，也是含环氧化合物解毒的主要途径(Decker等人，2009年;Kitteringham等人，1996年)。主要有两种亚型:mEH，由EPHX1基因编码(Hartsfield等人，1998年;Kerr等人。，1989年；Vaclavikova等人，2015），主要定位于内质网和sEH，由EPHX2基因编码，主要局限于细胞质(拉尔森等人，1995年)。两者均在哺乳动物肝细胞中高表达(《吉尔和吊床》，1980年;科勒等，2001)。利用人肝细胞，我们确定mEH是KZR-616及其类似物的主要酶介导代谢。酶动力学常数为KZR-616环氧水解使用重组酶，LMs，并在完整的细胞。这些研究表明，eh介导的LM代谢效率小于重组酶的5%，肝细胞是一种更有效的基于细胞的环氧水解系统。考虑到mEH也介导了carfilzomib和oprozomib的代谢，这是该类化合物代谢的一个共同途径。值得注意的是，与KZR-616不同，卡非佐米和奥普罗佐米在体内都显示肽酶水解是一种额外的代谢途径(王等人，2013年;王等人，2017年)。同样有趣的是，CFZ和KZR-616在猴子体内的体外血浆稳定性研究(未发表的数据)在37°C下6小时没有产生任何肽切割代谢物，环氧化物水解代谢物(二醇)均低于定量限制，表明商业猴血浆中同时缺乏肽酶和mEH。
综上所述，通过对体外试验系统和药代动力学数据的深入分析，确定KZR-616的主要代谢途径是mEH作用下环氧化物水解。这些数据表明，KZR-616的PK不太可能受到P450和sEH抑制剂/诱诱剂的共同给药的影响，也不太可能改变其他mEH和sEH底物药物的环氧水解。考虑到KZR-616广泛的组织分布和重组酶的代谢效率，很难在体内饱和这一过程。这表明，在共同使用已知或疑似mEH抑制剂时，KZR-616暴露改变的风险较低。
本文介绍的工作描述了肽环氧酮类似物的一系列体外和基于细胞的酶代谢和动力学研究。尽管有一些描述的局限性，肝细胞作为一个很好的体外测试系统来评估KZR-616和其他肽类环氧酮的代谢谱，并可能有助于在先导化合物优化过程中评估新型共价蛋白酶体抑制剂。
致谢
我们感谢Kezar生命科学公司的Celia Economides、Kiruthi Palaniswamy、Michelle Greenman和Mark Shiller审阅了手稿并提出了有益的建议。
作者贡献
参与研究设计:方，柯克，王。
进行实验:方，约翰逊，安德尔，穆查姆埃尔，麦克明，王。
提供新的试剂或分析工具:Morisseau,吊床。
执行数据分析：方,王。
手稿的写的或对手稿的写作有贡献的:方，莫里索，吊床，柯克，王。
脚注
- 收到了2020年的11月9日。
- 认可的2021年6月24日。
↵1.目前所属:加州大学戴维斯分校。
这项工作得到了Kezar Life Sciences的支持。
两位作者宣称他们没有相互竞争的利益。
↵
本文的补充资料可在www.1zgc.com．
缩写
- 1-ABT
- 1-aminobenzotriazole
- ADME
- 吸收、分布、代谢和排泄
- AUC
- 曲线下面积
- 牛血清白蛋白
- 牛血清白蛋白
- 氯int
- 固有间隙
- D8.kzr - 616
- 氘kzr - 616
- 嗯
- 环氧化物水解酶
- FA
- 甲酸
- H
- 人类
- 高级别
- 人类的肝脏微粒体
- 是
- 内部标准
- 信用证
- 液相色谱法
- LC-MS/MS
- LC -串联质谱
- LC-UV
- 带紫外检测的LC
- LM
- 肝微粒体
- LMP
- 低分子量多肽
- M
- 猴子
- 无聊的
- 微粒体环氧化物水解酶
- 传销
- 猴肝微粒体
- 太太
- 质谱分析
- NSPA
- 2-壬基磺酰胺基丙酰胺
- P450
- 细胞色素P450
- 主键
- 药代动力学
- 塞赫
- 可溶性环氧化物水解酶
- 系统性红斑狼疮
- 系统性红斑狼疮
- 所以
- 氧化二苯乙烯
- 肿瘤坏死因子-α
- 肿瘤坏死因子α
- TPPU
- 1-三氟甲氧基苯基-3-（1-丙酰哌啶-4-基）脲
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