摘要
生长因子在肝脏生理和病理中具有重要作用，特别是通过促进细胞增殖和生长。最近，有研究表明，在小鼠肝细胞中，表皮生长因子受体(EGFR)在抗癫痫药物苯巴比妥(phenobarbital)激活异种传感器构成雄烷受体(CAR)中起着至关重要的作用。由于CAR信号的物种选择性，我们在这里研究了表皮生长因子(EGF)在原代人肝细胞中CAR信号转导中的作用。在EGF存在或不存在的情况下，用人CAR激动剂CITCO或间接CAR激活剂苯巴比妥孵育原代人肝细胞。通过sirna沉默编码CAR和PXR的基因，评估了CAR-dependent基因表达调控和PXR参与这些反应的情况。EGF显著降低了CAR的表达，并阻止了CITCO和苯巴比妥(在较低程度上)对基因的诱导。在EGF缺失的情况下，苯巴比妥和CITCO分别调节144和111个基因在原代人肝细胞中的表达。在这些基因中，只有15个受CITCO调控，1个受苯巴比妥调控。相反，在EGF存在的情况下，CITCO和苯巴比妥仅以不依赖于car和pxr的方式调控基因表达。总的来说，我们的研究结果表明，在原代人肝细胞中，EGF主要通过转录调控特异性地抑制CAR信号，并驱动对妊娠X受体(PXR)介导机制的外生反应。
介绍
肝脏是一个代谢活跃的器官，主要通过肝细胞的代谢功能对大量的外源性和内源性化合物进行生物转化。这些活动受到转录因子网络的精细调控。其中，已知有两个核受体控制关键解毒酶的表达:妊娠X受体(NR1I2)和组成雄烷受体(CAR, NR1I3) (Wang et al.， 2012)．它们也可能参与癌症的发展和耐药性(de mattia等，2016年)．此外，越来越多的证据表明，它们调节大量内源性信号，并与参与调节胆汁酸、脂类、激素、葡萄糖、炎症、维生素和其他内源性物质(Wagner等人。，2005年；Pascussi等，2008年；Wada等人，2009年)．PXR活化可加重脂肪变性、肥胖和胰岛素抵抗(周等，2006，2008；李等，2012)．相反，CAR活化通常被认为是有益的，因为它可以维持胆固醇和胆汁酸的稳态，降低血糖和脂肪变性。然而，CAR对脂质代谢的影响在人原代肝细胞中没有重现(Lynch等人。，2014年)．
考虑到CAR和PXR在转化外源药物和调节细胞代谢方面的核心作用，许多研究都集中在识别和开发调控其活性的分子。然而，PXR和CAR功能的研究受到一些因素的阻碍。事实上，CAR和PXR之间的串扰通过识别共同的反应元件触发重叠靶基因的相互激活，协调肝脏反应(谢等人。，2000)．例如,CYP2B6是人类CAR的靶点，但也可被利福平(rifampicin, RIF)有效诱导，RIF是一种特异性PXR激活剂(古德温等人，2001年)．类似地，CAR可以调节CYP3A4， PXR靶基因原型(Maglich等人，2002年)．此外，CAR和PXR作为异源二聚体与视黄X受体(RXR, NR2B1)共同作用，并共享共激活因子，如SRC-1和PGC-1α，以及辅阻遏因子，如SMRT和NCoR (Oladimeji et al.， 2016)．因此，识别car特异功能和靶基因是一项挑战。
已经发现了物种特异性的直接CAR激动剂，如6-(4-氯苯基)咪唑[2,1-b][1,3]噻唑-5-卡巴醛O-(3,4-二氯苯)肟(CITCO) (Maglich等人，2003年)和1,4-二-[2-(3,5-二氯吡啶氧基)]苯，3,3 '，5,5 ' -四氯-1,4-二(吡啶氧基)苯(TCBOBOP) (Tzameli等人。，2000)用于鼠标CAR。相反，苯巴比托(PB)是一种间接的CAR激活剂，不直接与CAR配体结合域相互作用，因此不显示物种特异性。孕烯醇酮16α-丙烯腈特异性地激活小鼠PXR，而抗生素RIF激活人类而不是小鼠PXR。人的PXR也可以被PB通过受体结合机制激活，与PB介导的CAR激活的受体结合独立机制不同(摩尔等人，2000年)．PB的汽车激活是关键分子启动事件，并在啮齿动物中促进肝癌发生。人类没有报告Pb的致癌效果（欢迎combe等人，2014年)．
越来越多的证据表明，在肝再生和癌变过程中，外源代谢受到抑制。这刺激了对生长因子和细胞因子参与CYP酶下调的研究，因为它们在肝脏再生和疾病中的重要作用(Berasain和Avila，2014年)．例如，EGF抑制CYP2BPB诱导小鼠和大鼠肝细胞基因表达(河村等，1999；小池等人，2007年)．此外,EGF-mediatedCYP2B6对人肝细胞的抑制伴随着强烈的车信使rna表达(巴希达等人，2009年)．最近发现汽车和EGFR之间的串扰（Mutoh et al.， 2013)进一步强调了细胞增殖/存活与肝脏解毒/代谢之间的联系。早期和近期的研究表明PB通过阻止EGFR磷酸化来激活CAR的转录活性(Mutoh et al.， 2009；根岸英一,2017)．最近，我们发现EGF刺激CAR的同源二聚，从而迫使CAR处于非活性状态(Shizu et al.， 2017)．实际上，通过偶发二聚体 - 单体转化来调节汽车配体（Citco）和间接活化剂（Pb）的汽车激活（Shizu et al.， 2017)．此外，在人细胞系和小鼠肝细胞中，PB与EGF竞争与EGFR结合(Mutoh et al.， 2013)．
迄今为止，EGF对原代人肝细胞(PHHs)中CAR信号转导的影响尚未被研究。该模型比人肝细胞系具有优势，如转录因子和共调节分子的生理表达和人CAR在细胞质中的定位。我们使用人CAR激动剂CITCO和人CAR间接激活剂PB，研究了EGF对PHHs中CAR转录活性的影响。我们还用特定的sirna下调CAR以识别特定的靶标/反应。我们发现EGF如预期的那样降低了CAR靶基因的转录，也降低了CAR，但没有降低PXR的表达。EGF显著影响PHH对直接(CITCO)或间接(PB)激活剂的应答，并阻止car依赖的基因表达。最后，我们证明了在EGF存在的情况下，CAR的靶基因不是由PB通过CAR调控的，而是通过PXR调控的。
材料和方法
人原代肝细胞的分离与培养。
PHHS由Biopredic International（Rennes，France）或孤立提供，如前所述（Pichard等人，2006年)，来自不适合移植的供体器官，或出于与我们的研究项目无关的医疗原因对成人患者进行的肝脏切除。肝脏样本取自蒙彼利埃大学医院生物资源中心(CRB-CHUM;http://www.chu-montpellier.fr.；生物样本库编号:BB-0033-00031)，这项研究得益于Jeanne Ramos博士(肝脏胃肠病学样本收集)和Sylvain Lehmann教授(CRB-CHUM经理)的专业知识。患者的临床特点见表1．该手术由法国伦理委员会批准，并获得患者或其家属的书面或口头同意。
PHHs在confluent (4.105细胞/孔)，在胶原蛋白包覆的24孔培养皿中培养，5% CO2肝细胞生长培养基37°C的加湿气氛（补充5的WME培养基µ0.1 g / ml胰岛素µ氢化可的松,10µg / ml转铁蛋白,250年µg/ml抗坏血酸、3.75 mg/ml无脂肪酸牛血清白蛋白、2 mM谷氨酰胺、青霉素和链霉素)。当提示时，肝细胞生长培养基中添加10 ng/ml EGF (Peprotech, Neuilly-Sur-Seine, France) (Ismail等人，1991年；Katsura等，2002)．
核转染。
粘附PHHs用10 nM扰乱siRNA (siCT)或ON-TARGET + SMARTpool sinas(四种人专用sinas池)转染NR1I3(编码CAR的基因)或人类NR1I2(编码PXR的基因)(Dharmacon, Lafayette, CO)在播种后的第2天和第5天使用Lipofectamine RNAiMAX (Life Technologies, Carlsbad, CA)。在播种后第5天，PHHs与0.5 mM PB、1µM提交10µM RIF（Sigma，St.Louis，Mo）或载体（二甲基磺酰氧化物）24小时。
RNA分离和定量PCR。
使用TRIzol试剂(Invitrogen/Life Technologies)提取RNA，然后使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Applied Biosystems, Foster City, CA)对总RNA进行逆转录(RT)。定量PCR (qPCR)都使用了罗氏赛博绿色试剂和LightCycler 480设备(罗氏诊断、Meylan、法国)以下项目:一步一个脚印的95°C 10分钟左右,然后50周期在95°C的变性10秒,15秒退火在65°C,伸长为15秒72°C。引物序列列于表2．
微阵列数据采集。
扩增总RNA（500ng）并标记在GeneChip HT HG-U133 + PM阵列板上杂交。根据制造商的指示（Affymetrix，High Wycombe，UK）获取数据。对于每个条件，使用了五种生物学复制。为了获得强度值信号，使用Affymetrix GCOS 1.4软件处理扫描板，并且使用算法的鲁棒多芯片平均值（RMA）实现来归一化ydymetrix cel文件。在...的原始微阵列数据中，在基因表达式omnibus中可用，其中包含加入号GSE68493http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/．
微阵列数据分析。
使用网络工具Genomicscape (genomicscape.com)对微阵列数据进行分析(Kassambara等人，2015年)．简单地说，使用S.D.最高的15000个探针组对微阵列进行配对显著性分析。显著性使用Wilcoxon检验和显著失调基因(fold change, FC， >1.3;错误发现率<5%)。维恩图是使用Venny工具生成的(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)．利用聚类3.0和Treeview制作了已鉴定的感兴趣基因的热图。最后，利用KEGG[京都基因和基因组百科全书(KEGG)]和STRING网络工具(http://string-db.org)．
蛋白质分析。
使用含有蛋白酶抑制剂鸡尾酒的RIPA裂解缓冲液从PHH培养物中提取总蛋白(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)。根据生产商的说明书(Pierce Chemical, Rockford, IL)，使用双茚二酮酸法测定蛋白质浓度。蛋白质(20μg/样品)在10%预制sds -聚丙烯酰胺凝胶(Bio-Rad实验室，Marnes la Coquette，法国)上分离，转移到聚偏氟乙烯膜(Bio-Rad实验室)。用抗CYP2B6和GAPDH的抗体(sc-67224和sc- 3233;圣克鲁斯生物技术)。用辣根过氧化物酶标记的小鼠二抗(Sigma)检测免疫复合物，然后增强化学发光(Millipore, Molsheim，法国)。使用ChemiDoc-XRS+仪器(Bio-Rad Laboratories)采集信号，并使用图像实验室软件(4.1版本)进行量化。
DigiWest。
NUPAGE SDS-PAGE凝胶系统（Life Technologies）用于蛋白质分离和印迹。蛋白质（18.μ根据制造商的说明，使用4％-12％的BIS-TRIS凝胶分离G每样）。在标准条件下进行印迹PVDF膜（Millipore）。对于高含量的Western印迹分析，如上所述进行Digiwest程序（Treindl等人，2016年)．
统计分析。
定量PCR结果以均数±S.E.M.表示t测试。在以下情况下，差异被认为具有统计学意义P< 0.05。
结果
EGF强烈影响PHHs的基因表达。
首先，在具有10ng / ml EGF的长期孵育（第0天至第5天）后监测PHHS中的EGFR途径活性。ERK1 / 2（在T202和Y204），MEK1 / 2（在S217和S221）和直接下游激酶RSK1（P90RSK T573）的磷酸化证明了EGFR途径在与配体孵育时持续活化（图1一个)．
与EGF孵育后PHHs的差异基因表达。(A)蛋白在PHHs (Liv10，表1在孵育或不含10ng / ml egF后5天后。（b）EGF处理的PHHS中上调基因数和富集的途径[假发现率（FDR）= 4.7×10−18-1.9×10−5］．(C) egf处理的PHHs中下调基因和富集途径的数量(FDR = 8.8 × 10)−10-0.008)。(D)显示PHHs中差异表达基因的热图(n= 5)与EGF孵育后。
然后，在相同时期(第0天至第5天)，对与EGF孵育或未孵育的PHHs进行全球转录组分析。与对照组(无EGF)相比，在EGF处理的培养中，有328个基因(187个上调，141个下调)表达解除。KEGG通路富集分析揭示了差异表达基因对特定生物学过程的贡献。EGF孵育后上调的基因主要分布在14个KEGG通路中，这些通路主要与细胞增殖和癌症相关(Komposch and Sibilia, 2015) （图1 b)．相反，与EGF孵育时下调的基因主要属于代谢相关的KEGG通路。“雷竞技客服药物代谢细胞色素P450”和“细胞色素P450对外源性药物的代谢”是5个最受调控的信号级联(图1 c)．对最显著解除调控的基因(35个上调基因和35个下调基因)的无监督层次聚类清楚地表明，尽管个体间存在变异，但PHH样本根据是否与EGF孵育而分离(图1 d)．NR1I3（星号in.图1 d）编码汽车，主监管机构CYP2B6基因诱导，在与EGF温育后下调的基因（Fc = 0.31，q = 0.009）。
EGF降低了CAR和CAR- target基因的表达。
为了确定EGF在PHHs中CAR表达和信号转导中的作用，将细胞与CITCO(一种CAR激动剂)或PB(一种间接的CAR激活剂)孵育24小时(从种子后的第2天到第3天)，EGF存在或不存在10 ng/ml。CITCO在不激活PXR的低浓度下使用(Maglich等人，2003年)．为了排除由于长期治疗而产生的间接影响，EGF在激活剂使用前(第0天)或同时(第2天)添加。RT-qPCR分析证实，与未处理细胞(UT)相比，EGF特异性、重复性地降低了CAR mRNA水平(图2一个)，但对PXR mRNA表达有轻微影响(未显示)。其次，由于PB可以同时激活CAR和PXR (Lehmann等，1998年；摩尔等人，2000年)，它们的原型靶基因的表达CYP2B6（Sueyoshi等人，1999年） 和CYP3A4被监控。在没有EGF的情况下，PB和CITCO孵育增加CYP2B6和CYP3A4与UT细胞的mRNA水平比较。相反，在CAR激活剂之前或伴随EGF孵育时，细胞数量显著减少CYP2B6CITCO及PB上调(图2 b）和CYP3A4，并在较低程度上由PB (图2 c)．值得注意的是,CYP2B6基础水平(UT样本)也受到培养基中EGF存在的显著影响(图2 b)．
EGF对PHHS的表达及其靶基因的表达影响。来自两个捐助者的PHHS（LIV1和LIV2，表1)与1µM CITCO, 0.5 mM PB，或二甲基亚砜(DMSO) (UT)，在没有或存在10 ng/ml EGF的情况下24小时。EGF于诱导物[0 (D0)]前或[2 (D2)]同时加入。的相对表达车(一),CYP2B6(B)CYP3A4（c）通过QPCR测量mRNA并标准化为RPLP0．在不含EGF的培养基中，结果相对于对照(UT)表达;＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P< 0.01，相对于对照组(无EGF);＃P< 0.05;＃＃P< 0.01，相对于对照组(UT)。
这些发现表明，EGF通过调节其表达和可能的活性，快速和更具体地靶向CAR信号在PHHs中。
EGF影响CAR诱导CYP2B6。
为了更好地理解EGF对CAR信号的影响，我们使用特异性小干扰rna (siCAR)和非靶向siRNA作为阴性对照(siCT)下调了CAR的表达。在第2天和第5天转染siRNA后，车独立于EGF孵育(从第1天到第5天)和第5天添加CITCO或PB孵育24小时后，mRNA表达降低约50% (图3)．并行，汽车抑制减少了CYP2B6基本表达由两倍(图3 b)，如表皮生长因子(图2 b)．在没有EGF的情况下，CYP2B6在siCT细胞中，经CITCO和PB孵育后，mRNA的诱导倍数分别为~ 15倍和~ 17倍。在car - depletion PHHs中，这种诱导减少了50%以上(图3 b(左)。在EGF存在下，CAR下调被取消CYP2B6而对PB诱导无显著影响(图3 b尽管EGF的存在受到很大影响CYP2B6信使rna水平。CYP2B6表达的Western blot分析证实了这些结果(图3 c)．在PHHs与CITCO和PB孵育后观察到的不同效果以及CAR下调的影响，提示EGF通过CAR影响CYP2B6的诱导。
汽车消耗抑制CYP2B6只有在没有EGF的情况下，由PB和CITCO诱导。来自5个供体(Liv3-7)的PHHs用对照(siCT)或CAR-targeting sinas (siCAR)转染。然后用0.5 mM PB和1µM CITCO或DMSO (UT) 24小时，含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)。的相对表达车(一)和CYP2B26(B) qPCR检测mRNA，归一化为RPLP0．结果在没有EGF的sict转染细胞中相对于UT表达。(C) Western blotting检测CYP2B6蛋白水平(以Liv12中的PHHs为代表实验)。以GAPDH蛋白表达量作为负载对照。在不含EGF的培养基中，结果相对于对照(UT)表达;＊＊＊P< 0.005，相对于对照组(siCT);＃＃＃P< 0.005，相对于对照组(UT)。
EGF对CITCO和PB反应的差异影响。
我们之前的观察仅限于CYP2B6这是典型的CAR靶基因。因此，我们通过转录组学分析来评估EGF对PHHs中CAR转录活性的影响。首先，为了确定受EGF影响的基因，我们分析了在EGF存在或不存在的情况下，sict转染的PHHs与CITCO或PB孵卵的转录组谱(图4,A和B)．与EGF存在/缺失无关，与CITCO孵卵相比，PB孵卵后更多的基因被解除调控(无EGF: 144 vs. 111;EGF: 109 vs. 58)，与PB的多效效应一致(Handschin和Meyer，2003)．此外，在EGF存在的情况下，大多数基因对PB或CITCO的反应是上调的(红色)，而在EGF不存在的情况下，这种效应是异质性的(上调和下调)。进一步的分析只揭示了这一点CYP2B6和体内CYP2A6基因表现(CITCO孵育后所有解除调控基因的1.2%)在EGF存在和不存在的情况下，CITCO均显著解除调控(图4)．然而，在EGF存在和不存在时，FC值是不同的(FC = 2.1 vs. 10.5CYP2B6,FC = 1.4 vs. 14.8体内CYP2A6基因表现)．另一方面，在PB培养过程中，45个基因(21.6%)中包括体内CYP2A6基因表现和CYP2B6)在EGF不存在和存在时均受到影响(图4 b），EGF在其FC上的弱效果（数据未显示）。功能表征证明，只有在没有EGF编码的药物代谢酶的情况下，Citco的大多数109个基因仅通过EGF的药物代谢酶进行，并且与异种乳代谢过程有关（表3)．对于不依赖于EGF的45个PB令人讨要的基因，观察到类似的模式（表4)．令人惊讶的是，在只有EGF存在的PB(64个基因)或CITCO(56个基因)解除调控的基因中，许多基因与mRNA加工有关。此外，在EGF缺失的情况下，大多数对PB反应的失调基因与脂质和类固醇代谢有关。
EGF对CITCO和PB的反应有不同的影响。维恩图显示了5个供体(Liv3-7)在与1µM CITCO (A)或0.5 mM PB (B)在无或存在10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下。在每个实验条件下，上调和下调基因的数量分别用红色和绿色表示。
最后，在与Pb孵育的SICT转染的PHHS中测量的基因的KEGG途径富集的比较（图5)或CITCO (图5 b)在有无EGF(相对于UT细胞)作用24小时后发现，在无EGF的情况下，无论如何处理，大多数富集的途径都属于代谢。在PB培养的培养基中，EGF对该图谱的影响很小。相反，在EGF存在的情况下，citco去调控的基因与任何富集的KEGG通路不再相关。
相对于未处理的细胞，来自5个供体(Liv3-7)的sict转染的PHHs与0.5 mM PB (A)或1µM Citco（B）在存在或不存在10 ng / ml EGF（来自D0）的情况下24小时。
CAR靶向基因的鉴定。
然后在siCAR转染下调CAR的PHHs中评估CAR在与CITCO或PB(含或不含EGF)孵卵后的基因诱导中的作用。基于它们在siCAR细胞中对CITCO或PB的无反应性，与siCT细胞相比，我们鉴定了一系列CAR靶基因(表5)．在SICT细胞没有EGF的情况下通过Citco解毒的111个基因中（图4)，只有15个基因被鉴定为car靶向基因。它们包括先前描述的CAR目标(CYP2B6，-2A6 / 7，-2C8 / 9,3A4 / 7/43，Ephx1，Alas1，和运动)及四个新潜力(RDH16, TSKU，CPEB3)及下调管制(TAGLN)基因(表5)．在无EGF的siCT细胞中PB诱导的144个基因中(图4 b),大多数(n= 140)以独立于car的方式调控。在铅处理的PHHs中，CAR靶点为数不多，CYP2B6和CYP2A6/7也是由CITCO诱导的，而STEAP2PB特异性下调。
在EGF存在的情况下，只有在siCT细胞中CITCO治疗后的58个基因解除了调控CYP2B6和体内CYP2A6基因表现由CITCO以依赖car的方式进行监管。相反，在EGF存在下与PB孵育时，没有基因以car依赖的方式被调控(表5)．
通过QPCR分析验证了这些结果。在SICT细胞，体内CYP2A6基因表现和CYP2A7（图6,A和B)在无EGF的情况下，PB和CITCO同样诱导。这种诱导在CAR下调(siCAR)后被强烈抑制。在EGF存在的情况下，诱导体内CYP2A6基因表现和CYP2A7在siCT细胞中显著降低了CITCO和PB。CAR下调后，citco介导的诱导被取消，而pb介导的诱导受影响较小CYP2B6（图3 b)．在没有EGF的情况下，CYP3A4，CYP3A43，CYP3A7，CYP2C8，CYP2C9、TSKU EPHX1,运动（图6,C-J；表5)的上调依赖于CAR的表达，而大多数pb诱导的基因是不依赖于CAR的，但对于CYP2C8和TSKU．通过sicar介导的对citco诱导反应的抑制程度监测，CAR的贡献在基因之间存在差异，并与EGF对基因表达的抑制作用呈正相关。在对照组(siCT)和car - depletion细胞中，添加EGF并没有改变PB对这些基因的FC诱导。相反，EGF完全消除了CITCO对这些基因诱导的影响(图6中,有氯)，如图所示CYP2B6（图3 b)．没有观察到这种模式CPEB3和STEAP2（图6，m和n)．这些结果表明EGF对PHHs的药物代谢反应有深刻的影响。雷竞技客服
来自两个捐助者的PHHS（LIV6和LIV7，表1)用对照(siCT)或CAR-targeting sirna (siCAR)转染。然后用0.5 mM PB, 1µ在是否存在10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。的相对表达体内CYP2A6基因表现(一),CYP2A7(B),CYP3A4(C),CYP3A43（d），CYP3A7(E),CYP2C8(F),CYP2C9(G),TSKU(H),EPHX1(我),运动(J),ALAS1(K),TAGLN（l），STEAP2(M)CEBP3（n）通过QPCR测量mRNA并标准化为RPLP0．结果在没有EGF的培养基中相对于未处理的sict转染PHHs (UT)表达。＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P< 0.01，相对于同一治疗组的对照组;＃＃P< 0.01;＃＃＃P< 0.005，相对于对照组(UT)。
分析EGF对PHH转录组的影响，突出了与无EGF培养的重要差异。由于CAR的表达受到EGF的抑制，因此在EGF存在的情况下，CITCO的作用是不存在的。令人惊讶的是，在EGF存在下，PHHs与CITCO孵卵时，仍有58个基因上调(图4)，其中55个基因也被PB解除了调控(图4 b)．
PHH转录组分析表明，1)EGF强烈影响异种传感器CAR的转录活性，2)PHH对PB的响应对EGF的敏感性远远低于对CITCO的敏感性，这表明这可能涉及到CAR无关的机制。
在EGF存在下，PXR调控CAR靶基因。
众所周知，在人类中PXR与CAR共享配体和靶基因(摩尔等人，2000年)．最近,坎德尔等人(2016)利用人肝细胞证明，CAR和PXR分别被CITCO和RIF激活，解除了相同的途径(包括药物代谢途径)。雷竞技客服我们的结果表明，EGF对CAR的表达有负面影响，在siCAR细胞中，PB仍然可以诱导一组基因。因此，我们假设在EGF存在的情况下，PXR可以代替CAR。为了验证这一假设，在EGF存在或不存在的情况下，我们评估了sirna介导的PXR (siPXR)下调后，CITCO和PB在PHHs中的作用。在sippxr转染的PHHs中，降低了50%PXR观察mRNA，独立于PB、CITCO或EGF的存在(图7)．CAR mRNA水平未受影响(图7 b)．与在siCAR细胞中观察到的不同，在没有EGF、PB-和citco介导的情况下CYP2B6PXR下调不抑制诱导(图7 c)．相反，在EGF存在时，pb介导CYP2B6PXR下调显著降低诱导，而citco介导的诱导不受影响。CYP3A4只有在EGF缺失的情况下，CITCO才上调mRNA (图。2B.和7 d；表5），其PB的诱导依赖于PXR，无论是在eGF的存在还是不存在下。这些数据表明，在EGF存在下，PB效果CYP2B6和CYP3A4表达可以通过PXR而不是CAR介导。这被sirna介导的CAR和PXR下调证实(图7 e)．确实，在EGF存在的情况下，诱导Cyp2b6， -3a4， -2c8， -2a6， -2a7， -3a43,TSKU通过PB（图7 f)在PXR(而非CAR)表达下调时显著降低。此外，这种效应在CAR和PXR都被沉默的细胞中增加，特别是对于体内CYP2A6基因表现和CYP2A7．
来自5个捐献者的PHHs (Liv3-7，表1)用对照(siCT)、CAR-targeting (siCAR)或PXR-targeting (siPXR) sirna转染。然后用0.5 mM PB, 1µ在含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。的相对表达PXR(一),车(B),CYP2B6(C),或CYP3A4(D)用qPCR法检测mRNA，归一化为RPLP0．结果在没有EGF的培养基中相对于未处理的sict转染PHHs (UT)表达。用siCT、siCAR和/或sippxr sirna转染Liv16的PHHs。然后，在含有10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用0.5 mM PB或DMSO孵育24小时。的相对表达车和PXR(E),CYP2B6，Cyp3a4、tsku、cyp2c8、cyp2a6、cyp2a7、cyp3a43(F) mRNA通过qPCR检测，归一化为RPLP0表达水平。结果在EGF培养基中相对于未处理的sict转染PHHs表达(白色条)。＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P< 0.01;＊＊＊P< 0.001相对于对照组。
最后，单独分析CITCO或PB(在没有EGF的情况下)在不同PHH培养中用于基因表达分析的影响(n= 8)表明citco介导的诱导CYP2B6样品中mRNA表达是可变的（图8)．此外，在Liv13和Liv15中，它显著低于PB介导的作用，Liv14相对于UT几乎没有诱导作用。同样，不同培养物中相对的CAR mRNA水平比PXR的异质性更大(分别从1到100和1到10，未显示)。比较8个样本的CITCO效应和PXR/CAR mRNA表达率，发现在EGF缺失时，PXR/CAR mRNA表达率较低(图8 b)(例如,高车信使rna表达),CITCO-mediatedCYP2B6诱导率高(图8)．相反，当PXR/CAR mRNA比例高(即低)时车信使rna表达),CITCO-mediatedCYP2B6诱导很低。在eGF的存在下，下调汽车表达，CYP2B6与PB相比，CITCO孵育后的诱导率较低(图8 c)， PXR/CAR mRNA比值较高(低CAR表达)(图8 d)．此外，在对CITCO反应较差的两个样本(Liv13和Liv15)中，sirna介导的CAR或PXR下调表明了这一点CYP2B6PB的上调依赖于PXR活性(图8 E和F），在存在和不存在EGF的情况下。
来自8位捐献者(Liv3-7和13-15，表10.5 mM PB, 1µ在含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。的相对表达CYP2B6qPCR测定，归一化为RPLP0在(A)或(C) EGF存在的情况下。无EGF(以LOG10表示)或有EGF(以LOG10表示)时PXR/CAR mRNA的表达比例。来自两个捐赠者(Liv13和Liv15，表1) (E和F)用对照(siCT)、CAR-targeting (siCAR)或PXR-targeting (siPXR) sirna转染。然后用0.5 mM PB, 1µ在含或不含10 ng/ml EGF(来自D0)的情况下，用M CITCO或DMSO (UT)处理24小时。的相对表达CYP2B6qPCR测定，归一化为RPLP0在EGF缺失或存在的情况下。结果在没有EGF的培养基中相对于未处理的sict转染PHHs (UT)表达。＊P< 0.05;Arunachal Pradesh，P< 0.01;＊＊＊P< 0.001。
总之，当CAR表达较低且EGF存在时，在pb靶基因诱导中观察到从CAR依赖性到PXR依赖性的切换。这一发现对靶向治疗的发展至关重要。
讨论
生长因子在肝脏生理中起着至关重要的作用，一些生长因子参与CAR的活性和表达已经被广泛研究。然而，关于EGF在PHHs中的作用的数据很少。在这里，通过使用直接和间接的CAR激活剂，我们证明了EGF影响的表达车和CYP2B6,典型的CAR靶基因，在PHHs中。然后我们发现在PHHs中很少有严格依赖CAR的基因。此外，在该细胞模型中，在EGF缺失或存在的情况下，间接的CAR激活剂PB调节基因表达存在差异，但主要是以CAR无关和pxr依赖的方式。这可能会影响药物调查研究的设计和解释。
在体外激活人的汽车后，很少有研究分析了PHH转录组型。坎德尔等人(2016)进行了核受体汽车，PXR和PPAR的诱导型转录组的基因组比较α在收购phh (坎德尔等人，2016年)．李等人。（2015）研究了全基因组的亲代和HepaRG细胞的转录组谱NR1I3被撞倒(CAR-KO)令人惊讶的是，在111个受CITCO差异调控的基因中，我们只发现了15个CAR靶基因，在144个受PB影响的基因中，我们只发现了4个CAR靶基因。相反,李等人。（2015）发现在HepaRG细胞中，135个基因和120多个基因的表达分别受到CITCO和PB的影响，并以car依赖的方式(李等人，2015)．解除调控基因数量的差异可能与细胞类型有关(HepaRG细胞vs. PHHs)。此外，通过siRNA沉默CAR只导致大约50%的下降车PHHs中mRNA的表达。因此，我们不能排除剩余的CAR蛋白足以调节基因表达，我们只识别了主要的CAR靶标。然而，观察到CYP2B6在与Citco治疗后，在汽车耗尽的肝细胞中表达明显下调，表明沉默策略是有效的。此外，已经报道了PB和CitCo偏移效应（上田等人，2002年；李等人，2015)．因此，我们的结果与PB的非特异性和多效性作用及其可能的PXR交叉激活相一致，也突出了缺乏描述的CAR-independent CITCO活性。
大多数已鉴定的CAR靶基因都已被描述过(Alas1，POR，CYP2A6 -2A7 -2B6 -2C8 -2C9 -3A4 -3A7，EPHX1) （坎德尔等人，2016年)，仅发现4个新基因，其中3个经PCR验证(TSKU，TAGLN，RDH16)．CYP2B6，体内CYP2A6基因表现,CYP2A7是唯一被PB和CITCO以car依赖性方式调控的基因。体内CYP2A6基因表现和CYP2A7位于附近CYP2B6在19q13.2染色体上，可能涉及共同的调节机制。因此，一些研究发现体内CYP2A6基因表现（Maglich等人，2003年；Itoh等人，2006年） 和CYP2A7（坎德尔等人，2016年）由Citco诱发PHHS。TSKU是由PB在HepaRG细胞和PHHs (Lambert et al.， 2009)，并受成骨细胞中的PXR调控(Ichikawa等人。，2006年)．TAGLN,本研究中发现的一个被CAR下调的新基因，其编码的transgelin主要在星状细胞和成纤维细胞中表达(Petkov等人，2004年)．我们不能排除PHHs可能被非实质细胞污染。视黄醇脱氢酶16 (RDH16)参与视黄醇的合成。其表达随PPAR增加而增加αphhs中的激活（坎德尔等人，2016年)．在硅分析中，发现其调控区域存在推定的DR3和DR4基元，表明CAR (Ebert等人，2016年)．我们的结果表明，在PHHS中，只有很少的基因是严格的轿车依赖性，表明互补机制可以促进与血管生物学相关基因的表达。这可以分解人与小鼠之间的差异。研究啮齿动物的汽车转录调节，使用体内和体外方法可以帮助理解我们的发现是否特异于PHHS，或者由2D培养模型偏向。实际上，基因表达（Lauschke等，2016b)及能量代谢(Fu et al.， 2013)当人/啮齿动物肝细胞被培养后，模式会迅速改变。因此，尽管PHHs是与人类研究最相关的细胞模型，但使用该系统获得的体外数据应谨慎解释。在过去的十年中，模拟体内情况的细胞培养策略已经发展起来。肝细胞在三维球体中培养(巴赫曼等人，2015年；贝尔等人。，2016年；Vorrink等人，2017年)，不论是否存在基质细胞(Khetani和Bhatia, 2008年)，以及是否与中等通量相关(Vinci et al.， 2011；林等人。，2015年；Lauschke等，2016a)．转录组学、蛋白质组学和代谢组学分析表明，这些条件有利于长期维持细胞活力和体内类肝表型。与2D培养条件相比，这一过程中I期和II期酶、III期转运体、异种受体(CAR和PXR)和转录因子(HNF4)的稳定表达，以及细胞间接触、胆管结构和活性的改善。因此，从单层细胞转移到三维细胞培养系统可以大大提高核受体的表达和基因介导的调控(Vorrink等人，2017年)及药物代谢及毒性的体外评估(雷竞技客服Lin和Khetani，2016年)．
有研究表明，在EGF2B转基因小鼠的肝脏中，诱发恶性肿瘤的基因表达增加，而与视黄酸和外源性代谢相关的酶表达下调(Borlak等人，2005年)．有趣的是，我们在PHHs中得到了类似的结果。KEGG通路分析显示，在EGF存在的情况下，上调的基因大多属于细胞周期和癌变通路(Komposch and Sibilia, 2015)．此外，在EGF存在时，与药物代谢-细胞色素P450相关的通路下调(雷竞技客服图1 c)．这些通路在CAR-KO HepaRG细胞中也下调(Li et al. 2015)，提示egf介导的表型可以被解释，至少部分可以被CAR信号放松(李等人，2015)．在与CITCO孵育的PHHs中，相同的KEGG通路上调，这一假设得到了证实[本研究和坎德尔等人(2016)］．这种Citco介导的效果几乎完全消除了EGF（图5 b)．
在我们的模型中，我们观察到EGF也有类似的影响CYP2B6CITCO和PB短期培养诱导(第2天)(图2)．此外，在EGF存在的情况下培养6天后，由citco介导CYP2B6与PB介导的诱导相反(图3)．我们的转录组分析清楚地揭示了使用CITCO作为激活剂时EGF对CAR信号传导的强大作用。相比之下，PB反应几乎不受EGF的影响。这与PB的非特异性作用是一致的，但也提示了一种次级代偿机制。
CAR活性调控涉及多种机制，包括AMPK、胰岛素、EGFR和MEK-ERK信号通路(杨和王，2014；Yasujima等，2016年)．相反，汽车转录规则研究得很差。肝脏再生的肝营养因子增强器部分通过核因子部分降低人肝细胞的P450酶活性κB激活和CAR下调(Dayoub等人，2006年)．在小鼠HGF过表达的小鼠模型中，CAR而不是PXR mRNA表达减少(Kakizaki等人，2007)．评估其他生长因子和/或血清是否具有相似的pHHS和肝细胞中具有相似的抑制作用（Aninat等，2006)．此外，在HepG2细胞中，EGF和血清下调了CAR的表达，而PXR和视黄X受体的表达没有下调(Osabe等人。，2009年)，通过SAPK信号通路。这也可能发生在PHHs中。
HNF-4α, PGC-1α，糖皮质激素受体被认为是CAR启动子活性的主要调控因子(Pascussi等，2003年；丁等人。，2006年)．胰岛素样生长因子-1受体抑制剂(李等，2012)和甲状腺激素(OOE等，2009年)也可以调节CAR的表达。此外，miR-34-a (Lamba等人，2014年)和miR-137 (Chen et al.， 2014)导致NR1I3downregulation。HNF4α调节CAR的转录活性(冈萨雷斯,2008)和表达(丁等人。，2006年；Kamiyama等人，2007)．然而,HNF4α在我们的模型中，EGF不影响基因表达。直接HNF4α磷酸化是肝细胞中EGF作用的另一种可能机制(De Boussac等人，2010年；Vető等，2017)．
重要的是，我们发现在EGF存在的情况下，CAR不再调节其靶基因的表达(但对于CYP2B6和体内CYP2A6基因表现,在较低程度上)。利用基因沉默策略，我们可以证明PB优先诱导CYP2B6通过选择性的CAR激活，但当CAR的数量有限时(在EGF存在和CAR被人为下调时)，可以切换到PXR激活。研究发现，在EGF存在的情况下，许多由PB独立于CAR调控的基因是已知的PXR靶基因(例如，Cyp2b6、cyp3a7、cyp2c8、cyp3a4、ephx1、cyp3a43、cyp2c9、thrsp、alas1、abcc2、por、cyp3a5,ABCB1）进一步支持存在PXR介导的补偿机制，这些机制可能允许克服对潜在威胁的反应。该结论与人类PXR在汽车-KO肝细胞中观察到的汽车竞赛中的增强作用一致（李等人，2015)和不对称的监管CYP3A4和CYP2B6CAR或PXRFaucette等人(2006)．我们还观察到，药物代谢酶的诱导依赖于PXR/CAR比值。雷竞技客服类似地，先前的一份使用小鼠报告基因的报告显示，PXR/CAR比值在小鼠中起着关键作用Cyp2b10调制(Ding和Staudinger, 2005年)．考虑到CAR和PXR表达的个体间差异，这一观察结果可能对药物开发产生关键影响。
总之，我们的发现为EGF对PHHs中CAR活性的影响带来了新的见解，这可能与生理学相关，并强调了转录调节在CAR生物学中的重要性。CAR的转录调控可能在药物代谢和运输、能量稳态和细胞增殖中发挥着被低估的作用。雷竞技客服此外，与在啮齿动物中描述的结果不同，我们的工作表明，虽然EGF显著影响PHH对该药物的反应，但间接的CAR激活剂PB主要以非CAR依赖性的方式调节基因表达。使用最新的微流控和3D球形培养系统来评估这一效果将是很有趣的，在该系统中核受体表达得以维持(Lauschke等，2016a；Vorrink等人，2017年)．最后，CAR和PXR在CAR耗尽细胞中基因调控的切换突出了EGF存在下这些异种传感器之间的串扰。这种相声提供了一种机制，放大身体对各种化学物质的解毒反应。
除了他们在药物代谢中的主要作用外，汽车和PXR还是治疗癌症的潜在药理靶标（雷竞技客服de mattia等，2016年)和代谢性疾病，如胆汁淤积、非酒精性脂肪肝和糖尿病(Kakizaki等人，2007；高和谢，2012)．由于PXR和CAR可能不同地影响代谢途径，因此选择性地靶向这些受体是很重要的。在这种情况下，控制用于研究CAR活性的肝细胞的微环境和培养条件是至关重要的。
致谢
我们感谢A. Kassambara提供的生物信息学建议，感谢E. Vidal和F. Carol提供的技术支持。这项工作得益于蒙彼利埃大学医院中心(CHU)的转录组设备和该设施的科学经理Véronique Pantesco (v-pantesco@chumontpellier.fr)的专业知识。
作者的贡献
进行实验：de Bousssac, Gondeau, Briolotti, Duret, Treindl, Römer, Templin, gerbal - chalin。
提供新的试剂和分析工具:Fabre，Herrero，Ramos，Maurel。
执行数据分析:De Bousssac，Gerbal-Chaloin，Daujat-Chavanieu。
手稿的写的或对手稿的写作有贡献的:De Bousssac，Gerbal-Chaloin，Daujat-Chavanieu。
脚注
- 收到了2017年9月19日。
- 接受2017年12月14日。
根据资助协议n°115001 (MARCAR项目)，导致这些结果的研究获得了创新医学计划联合事业(IMI JU)的资助。
↵1S.G.-C.和m.d.-c.是共同院胎。
缩写
- 车
- 本构雄烷受体
- CITCO
- 6-（4-氯苯基）咪唑[2,1-B] [1,3]噻唑-5-碳甲醛O- (3 4-dichlorobenzyl)肟
- CYP
- 细胞色素P450
- 表皮生长因子
- 表皮生长因子
- 表皮生长因子受体
- 表皮生长因子受体
- 足球俱乐部
- 褶皱变化
- ke
- 京都基因和基因组百科全书
- PB
- 苯巴比妥
- 聚合酶链反应
- 聚合酶链反应
- 收购PHH
- 主要人类肝细胞
- qPCR
- 定量聚合酶链反应
- PXR
- 孕烷X受体
- RIF
- 利福平
- UT
- 未经处理的
- 版权所有©2018由美国药理学协会和实验治疗
![Differential gene expression in PHHs following incubation with EGF. (A) DIGIWest analysis of protein expression in PHHs (Liv10, Table 1) following incubation or not with 10 ng/ml EGF for 5 days. (B) Number of upregulated genes and enriched pathways in EGF-treated PHHs [false discovery rate (FDR) = 4.7 × 10−18–1.9 × 10−5]. (C) Number of downregulated genes and enriched pathways in EGF-treated PHHs (FDR = 8.8 × 10−10–0.008). (D) Heat map showing the genes differentially expressed in PHHs (n = 5) following incubation with EGF.](http://www.1zgc.com/content/dmd/46/3/223/F1.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
![EGF influences specifically the expression of CAR and its target genes in PHHs. PHHs from two donors (Liv1 and Liv2, Table 1) were incubated with 1 µM CITCO, 0.5 mM PB, or dimethylsulfoxide (DMSO) (UT) for 24 hours in the absence or presence of 10 ng/ml EGF. EGF was added before [day 0 (D0)] or together [day 2 (D2)] with the inducers. The relative expression of CAR (A), CYP2B6 (B), and CYP3A4 (C) mRNA was measured by qPCR and normalized to RPLP0. Results are expressed relative to control (UT) in medium without EGF; *P < 0.05; **P < 0.01, relative to control (no EGF) in the same treatment group; #P < 0.05; ##P < 0.01, relative to control (UT).](http://www.1zgc.com/content/dmd/46/3/223/F2.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
